Produção de hibridomas e clones produtores de anticorpos monoclonais anti- Nucleosídeo trifosfato difosfohidrolase 1 (NTPDase-1) recombinante de Trypanosoma cruzi

Abstract

O protozoário Trypanosoma cruzi, é o agente etiológico da doença de Chagas. As ecto-nucleotidases da família E-NTPDases são enzimas capazes de hidrolisar nucleotídeos tri e/ou difosfatados nos seus produtos monofosfatados. A NTPDase-1 de T. cruzi é uma proteína presente na superfície do mesmo, com possibilidade de também ser secretada para o meio extra-celular. Sua função ainda não é totalmente esclarecida, porém dados recentes sugerem fortemente sua participação na infectividade e virulência do parasito sendo considerada um bom alvo para bloqueio da infecção. Devido a dificuldade de diagnóstico na fase crônica, a morbidade causada pela doença e a deficiência do tratamento, é de extrema importância o desenvolvimento de novas e mais eficientes metodologias de diagnóstico e tratamento, sendo, neste caso os anticorpos monoclonais uma poderosa ferramenta. A proposta do presente trabalho foi a produção de anticorpos monoclonais que reconhecessem especificamente a NTPDase-1 de T. cruzi em detrimento da NTPDase-1 de Leishimania infantum chagasi. Para isso realizou-se a expressão heterologa da NTPDase-1 em sistema bacteriano (E.coli BL-21) e sua purificação por cromatografia de afinidade em coluna de níquel-agarose (Ni-NTA). Utilizou-se para as imunizações dos camundongos a proteína obtida, sendo a confirmação e titulação do soro hiperimune realizada por dot-ELISA. Linfócitos B dos camundongos imunizados foram fusionados com células de mieloma (SP2/0) para obteção dos hibridomas, sendo 47,13% de hibridomas secretores de anticorpos anti-NTPDase-1 de T. cruzi, os hibridomas foram selecionados pelo método de ELISA indireto. Após a diluição limitante, 49 clones reconheceram a NTPDase-1 recombinante de T. cruzi o que representa aproximadamente 27% de clones positivos. Além disso 10 clones reconheceram também a NTPDase-1 de Leishmania infantum chagasi. Portanto, isolamos 39 clones que reconheceram especificamente somente a NTPDase-1 recombinante de T.cruzi.

The protozoan Trypanosoma cruzi is the etiologic agent of Chagas disease. The ecto-nucleotidases E-NTPDase family are enzymes that hydrolyze nucleotide tri-and / or diphosphate monophosphates in their products. The NTPDase-1 T. cruzi is a protein present on its surface, with the possibility of also being secreted into the extracellular milieu. Its function is still not completely understood, but recent data strongly suggest its involvement in virulence and infectivity of the parasite is considered a good target for blocking infection. Due to the difficulty of diagnosis in chronic phase, morbidity and disability caused by disease treatment, it is extremely important to developing new and more efficient methods of diagnosis and treatment, in which case the monoclonal antibodies a powerful tool. The purpose of this work was the production of monoclonal antibodies that specifically recognize the NTPDase-1 T. detriment cruzi NTPDase-1 Leishimania infantum chagasi. For assessing the expression of heterologous NTPDase-1 in bacterial system (E. coli BL-21) and its purification by affinity chromatography on nickel-agarose column (Ni-NTA). It was used for the immunization of mice to protein obtained, with the confirmation and titration of hyperimmune serum made by dot-ELISA. B lymphocytes from immunized mice were fused with myeloma cells (SP2 / 0) to obteção hybridoma, and 47.13% of hybridomas secreting anti-NTPDase-1 T. cruzi, the hybridoma were selected by ELISA methodo. After limiting dilution, 49 clones recognized the NTPDase-1 recombinant T. cruzi which represents approximately 27% of positive clones. In addition 10 clones also recognized the NTPDase-1 Leishmania infantum chagasi. Therefore, we isolated 39 clones that specifically recognized only the NTPDase-1 recombinant T. cruzi.