Aplicação da tecnologia de ultrassom para potencializar a hidrólise enzimática das proteínas da semente de abóbora: Efeito nas propriedades funcionais e biológicas dos peptídeos obtidos

Abstract

As proteínas de sementes de abóbora (PSA) apresentam potencial como matéria prima para a produção de hidrolisados multifuncionais. A hidrólise enzimática é preferível; entretanto, o alto custo das enzimas, o baixo grau de hidrólise e o longo tempo de reação limitam a proteólise em escala industrial. Para superar essas desvantagens, a tecnologia de ultrassom (US) pode ser utilizada para melhorar a performance enzimática. Desta forma, este estudo avaliou o efeito do US na hidrólise das PSA usando quatro enzimas comerciais (Alcalase®, Brauzyn®, Flavourzyme® e Neutrase®). Inicialmente, avaliou-se o efeito do US (40 kHz, 23,8W/L, pH 7,5, 25- 60°C, até 300 min) usando a Alcalase® em três situações: aplicação de US no pré- tratamento da enzima, no pré-tratamento do substrato e na reação assistida visando melhorar a taxa de proteólise, a concentração final de hidrolisados, a solubilidade e a atividade antioxidante in vitro. Na etapa seguinte, foi determinado o efeito do US (40 kHz, 23,8 W/L, pH 7,5, em diferentes temperaturas por até 180 min) no pré-tratamento da Brauzyn®, Flavourzyme® e Neutrase® através da avaliação das alterações induzidas pelo processo nas estruturas das enzimas e estas foram correlacionadas com as melhorias observadas nos parâmetros cinéticos da hidrólise e na solubilidade e atividade antioxidante in vitro dos hidrolisado obtidos. Após a aplicação do US na Alcalase® e na PSA foi observado que a atividade proteolítica aumentou até 10,3 e 50,1%, respectivamente, sugerindo potencialização da atividade de Alcalase® tratada e maior facilidade da hidrólise da proteína quando esta foi pré-tratada. Em condições potencializadas e assistidas por US, a hidrólise das PSA proporcionou um aumento na taxa (até 280%) e na concentração final de peptídeos solúveis em ácido tricloroacético (TCA) (até 24%). Consequentemente, os hidrolisados obtidos com a intervenção do US apresentaram maior solubilidade (≤148,1%) e maior capacidade de sequestro de radicais, conforme evidenciado pelos ensaios ABTS e DPPH. O pré- tratamento por US da Brauzyn®, Flavourzyme® e Neutrase® aumentou a atividade destas enzimas em até 20,8%, 22,4% e 22,7%, respectivamente. Por outro lado, emcondições mais drásticas de processo, o US promoveu uma redução na atividade até 28,0% (Brauzyn®), 73,2% (Flavourzyme®) e 19,3% (Neutrase®). Em condições de ativação e principalmente nas de inativação, observou-se que o US causou alterações nas estruturas terciárias das enzimas. Essas alterações levaram à mudanças nas macros características das enzimas (tamanho médio, IPD e pontecial zeta), impactando nas atividades residuais. Em condições de máxima ativação por US, a Flavourzyme® apresentou maior taxa de hidrólise (aumento de até 125% a 25°C) e a Brauzyn® e a Neutrase® apresentaram maior grau de hidrólise final (aumento de até 75% a 25°C e 76% a 40°C, respectivamente). Consequentemente, houve um aumento na solubilidade (destaque para Neutrase®) e atividade antioxidante in vitro (especialmente para Neutrase® e Flavourzyme®) dos hidrolisados. Portanto, o ultrassom pode ser estrategicamente usado para melhorar o perfil hidrolítico de proteases comerciais visando a produção de hidrolisados proteicos com propriedades biológicas e técnico-funcionais a partir da PSA. Palavras-chave: Ativação enzimática. Peptídeos. Proteases. Proteólise. Semente de abóbora. Sonicação.Pumpkin seed proteins (PSP) have the potential to generate multifunctional hydrolysates. Enzymatic hydrolysis is preferable, however, high cost of enzymes, low hydrolysis degree and long reaction time limit proteolysis on an industrial scale. To overcome these disadvantages, ultrasound (US) can be used to improve enzyme performance. Thus, this study evaluated the effect of US on PSP hydrolysis using four commercial enzymes (Alcalase®, Brauzyn®, Flavourzyme® and Neutrase®). Initially, the effect of US (40 kHz, 23.8W/L, pH 7.5, 25-60°C, up to 300 min) was evaluated using Alcalase® in three situations: application of US in the pre-treatment of enzyme, in the substrate pre-treatment and in the assisted reaction aiming to improve the proteolysis rate, the final concentration of hydrolysates, the solubility and the in vitro antioxidant activity. In the next step, the effect of US (40 kHz, 23.8 W/L, pH 7.5, at different temperatures for up to 180 min) in the pre-treatment of Brauzyn®, Flavourzyme® and Neutrase® was evaluated. The alterations induced by the process in the enzyme structures were correlated with the improvements observed in the kinetic parameters of the hydrolysis and in the solubility and in vitro antioxidant activity of the obtained hydrolysates. After the application of US to Alcalase® and PSP, it was observed that the proteolytic activity increased up to 10.3 and 50.1%, respectively, suggesting potentiation of the treated Alcalase® activity and greater ease of protein hydrolysis when it was pre-treated. treated. Under potentiated and US-assisted conditions, PSP hydrolysis provided an increase in the rate (up to 280%) and in the final concentration of soluble trichloroacetic acid (TCA) peptides (up to 24%). Consequently, the hydrolysates obtained with the intervention of US showed greater solubility (≤148.1%) and greater ability to scavenge radicals, as evidenced by the ABTS and DPPH assays. US pretreatment of Brauzyn®, Flavourzyme® and Neutrase® increased the activity of these enzymes by up to 20.8%, 22.4% and 22.7%, respectively. On the other hand, under more drastic process conditions, the US promoted a reduction in activity up to 28% (Brauzyn®), 73.2% (Flavourzyme®) and19.3% (Neutrase®). Under activation and inactivation conditions, it was observed that US caused alterations in the tertiary structures of the enzymes, especially under inactivation conditions. These alterations led to changes in the macro characteristics of the enzymes (average size, IPD and zeta potential), impacting the residual activities. Under conditions of maximum activation by US, Flavourzyme® showed a higher hydrolysis rate (up to 125% increase at 25°C) and Brauzyn® and Neutrase® showed a higher degree of final hydrolysis (up to 75% increase at 25°C and 76% at 40°C, respectively). Consequently, there was an increase in the solubility (especially Neutrase®) and in vitro antioxidant activity (especially for Neutrase® and Flavourzyme®) of the hydrolysates. Therefore, ultrasound can be strategically used to improve the hydrolytic profile of commercial proteases aiming at the production of protein hydrolysates with biological and technical-functional properties from PSP. Keywords: Enzyme activation. Peptides. Proteases. Proteolysis. Pumpkin seed. Sonication.