Validação do potencial anti-quorum sensing de compostos naturais e anti-inflamatórios em bactérias gram-negativas

Abstract

Quorum sensing (QS) é um mecanismo de comunicação célula-célula mediado por moléculas sinalizadoras que levam à expressão gênica diferencial em resposta a alta densidade populacional. Numerosas espécies de bactérias utilizam este mecanismo de comunicação intra e intercelular para promoverem as mudanças necessárias para adaptação em ambientes diversos. Chromobacterium violaceum é um patógeno humano oportunista que utiliza o QS mediado por acil homoserina lactonas (AHLs) para regular fenótipos como a formação de biofilme, produção de cianeto, síntese do pigmento violeta denominado violaceína, entre outros. Esta bactéria regula a produção de violaceína pelo sistema QS CviI/CviR, que produz e responde a AHLs de diferentes comprimentos de cadeia acila. Ao contrário do sistema de QS por AHLs completo presente em C. violaceum, em Salmonella, esse sistema é incompleto, devido a ausência da sintase da molécula sinal. Entretanto, Salmonella possui a proteína SdiA, homóloga a proteína LuxR, que permite detectar as AHLs produzidas por outras bactérias. Neste trabalho, foi realizada a prospecção in silico de moléculas indutoras do mecanismo de quorum sensing assim como, de prováveis inibidores (quorum quenching-QQ) de C. violaceum e testes in vitro foram realizados para avaliar o efeito destes compostos sobre a produção de violaceína. Além disso, foi testado o efeito do composto fitol e furanona na interferência de processos regulados por QS no metabolismo de Salmonella. Testes in silico mostraram que as AHLs, compostos de plantas e anti-inflamatórios não esteroides (AINEs) foram capazes de se ligar a proteína CviR de C. violaceum com altos escores de afinidade. Além disso, testes in vitro mostraram que a maioria dos compostos testados inibiu a produção de violaceína, sendo que, dentre os compostos de plantas, concentração de 600 µg/mL de ácido margárico e ácido palmítico foi mais efetiva para inibir a produção de violaceína por C. violaceum ATCC 12472 e mutante CV026. No entanto, dentre os AINEs testados na concentração de 500 µg/mL, somente o cetoprofeno mostrou inibição deste fenótipo nas duas estirpes. O crescimento de Salmonella na presença de 0,05 µM de N-dodecanoyl-homoserina lactona (C12-HSL), 0,05 µM de furanona ou 600 µg/mL de fitol durante 24 h de incubação em condições de anaerobiose não foi inibido. Entretanto, na presença de C12-HSL a concentração de tiol livre aumentou em fase exponencial de crescimento com 6 e 7 h de incubação, mas retornou ao mesmo nível observado em células cultivadas na ausência de C12-HSL, quando furanona e fitol foram adicionados na cultura, comparado com o tratamento controle. Os níveis de coenzima NADPH foram significativamente aumentados na presença de C12-HSL, furanona e fitol, enquanto o consumo de glicose foi menor em 6 h de incubação com C12-HSL. A produção de ácidos orgânicos em condições anaeróbias não foi afetada pelas moléculas de QS e QQ. Os resultados do presente trabalho mostraram a importância do docking molecular como uma ferramenta in silico válida para prospecção de compostos QQ em bactérias. A maioria dos compostos indicados in silico como potenciais QQ e testados in vitro inibiu a produção de violaceína em C. violaceum, indicando que podem interferir com o mecanismo de comunicação celular. Além disso, os resultados da influência de moléculas de QS e QQ sobre alguns processos metabólicos em Salmonella revelam a importância de conhecer e compreender os efeitos destes compostos, a fim de encontrar maneiras de reduzir a patogenicidade e, portanto, diminuir o número de surtos de salmonelose registrados em todo o mundo.Quorum sensing (QS) is a mechanism of cell-cell communication mediated by signal molecules that lead to differential gene expression in response to high population density. Numerous species of bacteria use this mechanism of intra and intercellular communication to promote the changes necessary for adaptation in diverse environments. Chromobacterium violaceum is an opportunistic human pathogen that uses the QS mediated by acyl-homoserine lactones (AHLs) to control biofilm formation, cyanide production, synthesis of a violet pigment called violacein, among others. This bacterium regulates the production of violacein by the QS system CviI/CviR, which produces and responds to AHLs of different acyl chain lengths. Unlike the complete AI-1 QS system present in C. violaceum, in Salmonella, this system is incomplete, because there is no synthesis of the AHL signal molecule. Meanwhile, Salmonella has the SdiA protein, homologous to the LuxR protein, which allows the detection of AHLs produced by other bacteria. In this work, a screening of quorum sensing and quorum quenching (QQ) molecules in C. violaceum was performed and in vitro tests were carried out to evaluate the effect of these compounds on violacein production in this microorganism. In addition, the effect of the phytol and furanone compounds were tested on the interference of QS- regulated processes in Salmonella metabolism. The in silico tests showed that AHLs, plant compounds and non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) were able to bind to the CviR protein of C. violaceum showing high scores of affinities. In addition, in vitro tests showed that most of the tested compounds achieved an inhibition in violacein production, whereas, among the plant compounds, a concentration of 600 μg/mL of margaric and palmitic acid were effective against C. violaceum ATCC 12472 and mutant CV026. However, within the NSAIDs tested, only ketoprofen compound showed inhibition of this phenotype in the two strains. Growth of Salmonella in the presence of 0.05 μM of N-dodecanoyl-homoserine lactone (C12-HSL), 0.05 μM of furanone or 600 µg/mL of phytol for 24 h incubation under anaerobic conditions was not inhibited. In the presence of C12-HSL, free thiol levels increased at 6 and 7 h of incubation but returned to the same level observed in cells cultured in the absence of C12-HSL, when phytol and furanone were added in broth, compared to the control treatment. NADPH coenzyme levels were significantly increased in the presence of C12-HSL, phytol, and furanone, whereas glucose consumption was lower in 6 h of incubation with C12-HSL. The production of organic acids under anaerobic conditions was not affected by QQ or QS molecules. The results of the present work showed the importance of molecular docking as a valid in silico tool for prospecting QQ compounds in bacteria. Most compounds tested in vitro inhibited the violacein production in C. violaceum, indicating that they may interfere with the mechanism of cellular communication. In addition, the results of the influence of QS and QQ molecules on some physiological processes in Salmonella, reveal the importance of knowing and understanding the effects of these compounds, in order to find ways to reduce the pathogenicity and, therefore, to reduce the number of outbreaks of salmonellosis registered in all the world.