Integração de pAN7-1 no genoma de Magnaporthe grisea mediada por enzima de restrição

Abstract

Visando explorar a mutagênese insercional em Magnaporthe grisea, foram avaliadas a transformação dos protoplastos obtidos após adequação do protocolo e a eficiência da integração de pAN7-1 no genoma do ascomiceto na presença da enzima de restrição Hind III. Os protoplastos de M. grisea I-22 foram prontamente transformados para a resistência à higromicina. Quando o vetor linearizado com Hind III foi usado para transformar o fungo na presença de Hind III, a eficiência de transformação foi 1,1 a 8,1 vezes superior ao tratamento sem a adição da enzima. No geral, a melhor concentração de Hind III foi 5 unidades/reação de transformação. Tal concentração promoveu a produção média de 332 transformantes/µg de pAN7-1/107 protoplastos. A presença do gene de seleção hph no genoma de 18 indivíduos resistentes à higromicina foi confirmada por PCR.To investigate insertional mutagenesis in Magnaporthe grisea, we tested the transformation of protoplasts produced after protocol optimization, and analyzed the integration efficiency of pAN7-1 into the M. grisea genome mediated by the restriction endonuclease Hind III. The I-22 protoplasts were readily transformed for hygromycin resistance. When pAN7-1 was linearized with Hind III and used to transform fungal protoplasts in the presence of the corresponding enzyme, the transformation efficiency was increased 1.1 to 8.1-fold. The optimal Hind III concentration for enhanced transformation corresponded to 5 unit/transformation mix. This concentration led to average frequency of 332 transformants/µg de pAN7-1/107 protoplasts. The presence of selection gene hph in the 18 transformant genome was confirmed by PCR.