Análise da expressão temporal de oito genes candidatos a efetores de Phakopsora pachyrhizi e localização subcelular das proteínas codificadas em Nicotiana benthamiana

Abstract

Durante a sua interação com a soja, o fungo Phakopsora pachyrhizi secreta e transloca para a célula vegetal várias proteínas efetoras com função de suprimir as respostas de defesa e/ou favorecer o seu parasitismo. Por meio da análise do transcritoma da interação soja- Phakopsora pachyrhizi vários genes que codificam proteínas candidatas a efetoras já foram identificados, mas a função da maioria dessas proteínas na patogênese ainda é desconhecida. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi caracterizar genes candidatos a efetores de P. pachyrhizi, analisando a sua expressão temporal durante a infecção e localização subcelular das proteínas codificadas. Para isso, candidatos a efetores obtidos a partir de estudos de proteômica e transcritômica foram analisados e oito genes (EC3318, EC23, CSEP07, CSEP09, RTP1, HESP-C49, PHPA_29 e PHPA_43) foram selecionados, com base na expressão durante a infecção, presença de sequência codificadora do peptídeo sinal de secreção e alta identidade com genes que codificam proteínas efetoras de outras espécies de fungos causadores de ferrugens. Os genes selecionados apresentaram diferentes padrões de expressão, mas a maioria apresentou pico de expressão 24 horas após a inoculação, momento de início de formação dos haustórios do patógeno. As proteínas fusionadas a GFP foram expressas em folhas de Nicotiana benthamiana juntamente com proteínas marcadoras de compartimentos subcelulares e observadas em microscópio confocal de varredura a laser. A proteína EC23 se localizou exclusivamente no citoplasma, enquanto as proteínas EC3318, CSEP07, CSEP09, Hesp-C49, PHPA_29 e PHPA_43 se localizaram no citoplasma e no núcleo. O padrão de expressão dos genes e a localização subcelular das proteínas codificadas são condizentes com um provável papel efetor durante a patogênese em soja.During its interaction with soybeans, the fungus Phakopsora pachyrhizi secretes and translocates several effector proteins into the plant cell to suppress defense responses and/or to facilitate its parasitism. Through transcriptome analysis of the interaction between P.pachyrhizi and soybean, several candidate genes encoding putative effector proteins have been identified, but the function of the majority of these proteins in pathogenesis is still unknown. The objective of this study was to characterize P. pachyrhizi effector candidate genes, analyzing their temporal expression during infection and investigating the possible subcellular targets of the encoded proteins. Effector candidates sequences obtained from transcriptomics studies were analyzed and eight genes (EC3318, EC23, CSEP07, CSEP09, RTP1, HESP-C49, PHPA_29 and PHPA_43) were selected based on their expression during infection, presence of sequence encoding signal peptide for secretion and high identity with genes that encode effector proteins in others rust fungi. Different expression patterns were observed but most of the genes showed expression peaks 24 hours after the inoculation, stage in which the haustoria formation begins. GFP-fused proteins were expressed in Nicotiana benthamiana leaves together with fluorescence-tagged proteins that are markers of subcellular compartments. The EC23 protein was located exclusively in the cytoplasm, while EC3318, CSEP07, CSEP09, HEPEP-C49, PHPA_29 and PHPA_43 located in the cytoplasm and also in the cell nucleus, The gene expression pattern and the subcellular localization of the encoded proteins strongly indicate that the selected genes encode P. pachyrhizi effectors.