Prospecção, isolamento e atividade antimicrobiana de peptídeos de folhas de Mikania sp.

Abstract

Peptídeos antimicrobianos (AMPs) têm atraído a atenção de pesquisadores como pontenciais compostos de defesa para serem usados no agronegócio. O objetivo deste trabalho foi, por técnicas proteômicas, bioprospectar o potencial antimicrobiano de frações enriquecidas em peptídeos de folhas de guaco (Mikania sp.) contra fitopatógenos de importância comercial, visando aplicação biotecnológica. Folhas frescas de guaco foram maceradas em tampão Tris acrescido de inibidores de proteases, o homogenato foi centrifugado, e o sobrenadante foi nomeado extrato solúvel (ES). O precipitado foi ressuspendido em solução de LiCl contendo inibidores de proteases, o homogenato foi centrifugado e o sobrenadante foi denominado extrato de parede celular (EP). ES e EP foram fracionados por ultrafiltração em membranas com limite de exclusão de 3 e 30 kDa. Para avaliar o potencial antimicrobiano das frações protéicas de guaco, as frações ultrafiltradas ES>30kDa, ES3-30kDa, EP>30kDA e EP3-30kDa foram testadas contra cinco bactérias, Ralstonia solanacearum, Pseudomonas syringae pv. tomato, Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli, Erwinia caratovora subsp. caratovora e Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, e o fungo Fusarium oxysporum. O ES>30kDa inibiu o crescimento de todos os seis microrganismos testados. Os microrganimos mais susceptveis às fraçoes protéicas foram a bactéria Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis e o fungo Fusarium oxysporum. O procedimento de ultrafiltração foi essencial para a recuperação de grande quantidade de amostra parcialmente fracionada enriquecida em peptídeos. Com o objetivo inicial de confirmar a presença de AMPs nas frações ultrafiltradas, os extratos de guaco foram separados em SDSTricina-Page e as bandas de massa molecular sugestivamente enriquecidas em AMPs foram eletroeluídas e analisadas por espectrometria de massa em MALDITOF/ TOF. Com o mesmo objetivo, as frações ultrafiltradas foram separadas em C18-RP-HPLC e os picos analisados por espectrometria de massa, quando foram detectadas diversas moléculas com massas moleculares entre 4.367,092 e 9.164,098 kDa. Os picos com massas moleculares semelhantes aos AMPs foram selecionados e estão sendo submetidos à proteólise limitada para a caracterização bioquímica dos peptídeos via peptide mass fingerprint e/ou, MS/MS. Estes extratos protéicos ou peptídicos, com atividade antimicrobiana, podem ser biotecnologicamente explorados para aplicação comercial como compostos de defesa.Antimicrobial peptides (AMPs) have being attracting the researcher s attention as potential components of the plant defense, to be used in the agribusiness. The objective of this work was, by using proteomic techniques, bioprospect the antimicrobial potential of peptide-enriched fractions from leaves of Mikania sp. for controling the growth of important plant pathogens, aiming biotechnological applications. Leaves were macerated with Tris buffer added of protease inhibitors, the homogenate was centrifuged, and the supernatant was named soluble extract (ES). The precipitate was resuspended in LiCl solution containing protease inhibitors, the homogenate was centrifuged and the supernatant was named cell wall extract (EP). Both ES and EP were fractionated by ultrafiltration procedures by using membranes of 3 and 30 kDa cut-off. To evaluate the antimicrobial potential of the peptide enriched fractions, the ultrafiltrated samples ES>30kDa, ES3-30kDa, EP>30kDA and EP3-30kDa were evaluated against five bacteria, Ralstonia solanacearum, Pseudomonas syringae pv. tomato, Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli, Erwinia caratovora subsp. caratovora and Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, and against the fungus Fusarium oxysporum. ES>30kDa inhibited the growth of the six assayed microorganisms. The best inhibition degrees were obtained for the bacterium Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis and the fungus Fusarium oxysporum. Considering the major objective of confirming the presence of AMPs in the ultrafiltered fractions, the extracts were separate by SDS-Tricine-PAGE, and the bands presenting molecular masses similar to AMPs were electroeluted and analyzed by mass spectrometry in a MALDI-TOF/TOF equipment. Also, the ultrafiltrated fractions were separated on a C18-RP-HPLC column, and the peaks were analyzed by mass spectrometry, when various molecular mass values were observed, from 4,367.092 to 9,164.098 kDa. The fractions with molecular masses similar to AMPs were selected for development of limited proteolysis for biochemical characterization of the peptides through peptide mass fingerprint and/or MS/MS. These protein or peptide extracts, presenting antimicrobial activity, could be biotechnological explored for commercial application as defense agents.