Nuclear immune mechanisms associated with begomovirus infection

Abstract

Plants are constantly exposed to different biotic and abiotic stresses and, as sessile organisms, have evolved complex mechanisms to recognize and respond to adverse environmental conditions. Plant immunity involves different layers of recognition and signaling, including pattern-triggered immunity (PTI) and effector-triggered immunity (ETI), which activate molecular and physiological responses that can limit infection. As obligate intracellular parasites, plant viruses face challenges because they depend on host machinery and host factors for replication, gene expression, and intracellular movement. Among plant viruses, begomoviruses, in the family Geminiviridae, possess single-stranded DNA genomes and depend on both viral and host proteins to complete their infection cycle. Following nuclear replication, viral DNA (vDNA) associates with the nuclear shuttle protein (NSP), which participates in the nucleocytoplasmic trafficking of vDNA in association with the NSP-interacting GTPase (NIG). The dependence of host factors involved in vDNA trafficking represents an important connection between viral infections and antiviral defense. In Arabidopsis thaliana, AtWWP1 contributes to antiviral defense by recruiting NIG into nuclear bodies and reducing its availability for vDNA movement. Although the formation of these nuclear bodies depends on the WW domains, here we showed that AtWWP1 is also associated with cyclin-dependent kinase 2 (CDKC2), which phosphorylates the C-terminal domain (CTD) of RNA polymerase II and is associated with nuclear speckles and spliceosome components, suggesting a possible connection between AtWWP1 nuclear bodies and transcriptional processes. However, the mechanisms that control the organization and composition of these nuclear bodies, and their contributions to antiviral defense, remain poorly understood. A methyl-CpG-binding domain, AtMBD2, was identified as an interactor of AtWWP1. AtMBD2 recognizes CpG-methylated regions and is associated with chromatin regulation, transcriptional repression, DNA demethylation, and gene expression, suggesting that its recruitment to AtWWP1 nuclear bodies may connect these structures with epigenetic and transcriptional mechanisms during infection. Here, we demonstrated that AtMBD2 interacts with AtWWP1 in vivo and is redirected from the nucleoplasm to AtWWP1-derived nuclear bodies. Domain-mapping analysis revealed that this interaction is independent of the AtWWP1 WW domain and instead requires its C-terminal region, spanning amino acids 273-463. Functional analysis further demonstrated that AtMBD2 modulates begomovirus infection, as its overexpression increases viral DNA accumulation, whereas genetic inactivation of AtMBD2 reduces viral load relative to the wild-type Col-0 line. Although these alterations were not fully correlated with disease symptoms, they were accompanied by differential expression of defense-related genes, indicating that AtMBD2 affects host responses during infection. Collectively, these results reveal a previously uncharacterized connection between an epigenetic regulator and AtWWP1-derived nuclear immune bodies and suggest that the AtMBD2-AtWWP1 interaction contributes to the regulation of begomovirus infection through mechanisms involving nuclear organization and defense-related gene expression. This study provides new insights into the molecular organization of nuclear antiviral defense and the complex interplay between viral infection, host nuclear processes, and epigenetic regulation. Keywords: AtWWP1; AtMBD2; nuclear bodies; antiviral defenseAs plantas estão constantemente expostas a diferentes estresses bióticos e abióticos e, como organismos sésseis, desenvolveram mecanismos complexos para reconhecer e responder a condições ambientais adversas. A imunidade das plantas envolve diferentes camadas de reconhecimento e sinalização, incluindo a imunidade desencadeada por padrões (PTI) e a imunidade desencadeada por efetores (ETI), que ativam respostas moleculares e fisiológicas capazes de limitar a infecção. Como parasitas intracelulares obrigatórios, os vírus de plantas enfrentam desafios, pois dependem da maquinaria e dos fatores do hospedeiro para a replicação, a expressão gênica e o movimento intracelular. Entre os vírus de plantas, os begomovírus (família Geminiviridae) possuem genomas de DNA de fita simples e dependem tanto de proteínas virais quanto de proteínas do hospedeiro para completar seu ciclo de infecção. Após a replicação nuclear, o DNA viral (vDNA) associa-se à nuclear shuttle protein (NSP), que participa do tráfego nucleocitoplasmático do vDNA em associação com a NSP-interacting GTPase (NIG). A dependência de fatores do hospedeiro envolvidos no tráfego do vDNA representa uma conexão importante entre as infecções virais e a defesa antiviral. Em Arabidopsis thaliana, AtWWP1 contribui para a defesa antiviral ao recrutar a NIG para os corpos nucleares e ao reduzir a disponibilidade de NIG para o movimento do vDNA. Embora a formação desses corpos nucleares dependa dos domínios WW, foi demonstrado que a AtWWP1 também está associada à cyclin-dependent kinase 2 (CDKC2), que fosforila o domínio C-terminal (CTD) da RNA polimerase II e está associada a nuclear speckles e aos componentes do spliceossomo, sugerindo uma possível conexão entre os corpos nucleares de AtWWP1 e processos transcricionais. No entanto, os mecanismos que controlam a organização e a composição desses corpos nucleares, bem como suas contribuições para a defesa antiviral, permanecem pouco compreendidos. Um domínio de ligação a CpG metilado, o methyl-CpG-binding domain (AtMBD2), foi identificado como parceiro de interação com a AtWWP1. A AtMBD2 reconhece regiões com metilação em CpG e está associada à regulação da cromatina, à repressão transcricional, à desmetilação do DNA e à expressão gênica, sugerindo que seu recrutamento aos corpos nucleares de AtWWP1 pode conectar essas estruturas a mecanismos epigenéticos e transcricionais durante a infecção. Neste estudo, demonstramos que a AtMBD2 interage com a AtWWP1 in vivo e é direcionada do nucleoplasma para corpos nucleares derivados da AtWWP1. A análise de mapeamento de domínios revelou que essa interação é independente do domínio WW da AtWWP1 e requer sua região C-terminal, que abrange os aminoácidos 273 a 463. Análises funcionais demonstraram ainda que a AtMBD2 modula a infecção por begomovírus, uma vez que sua superexpressão aumenta o acúmulo de DNA viral, enquanto a inativação genética da AtMBD2 reduz a carga viral em comparação à linhagem selvagem Col-0. Embora essas alterações não estivessem totalmente correlacionadas aos sintomas da doença, foram acompanhadas de expressão diferencial de genes relacionados à defesa, o que indica que a AtMBD2 afeta as respostas do hospedeiro durante a infecção. Em conjunto, esses resultados revelam uma conexão anteriormente não caracterizada entre um regulador epigenético e corpos imunes nucleares derivados da AtWWP1, sugerindo que a interação AtMBD2-AtWWP1 contribui para a regulação da infecção por begomovírus por meio de mecanismos que envolvem a organização nuclear e a expressão de genes relacionados à defesa. Este estudo fornece novas perspectivas sobre a organização molecular da defesa antiviral nuclear e a complexa interação entre a infecção viral, os processos nucleares do hospedeiro e a regulação epigenética. Palavras-chave: AtWWP1; AtMBD2; corpos nucleares; defesa antiviral