Combinatorial effects of bovicin HC5 and epsilon-polylysine against Alicyclobacillus acidoterrestris in orange juice

Abstract

Alicyclobacillus acidoterrestris is a thermo-acidophilic spore-forming bacterium that can survive pasteurization procedures and cause spoilage of fruit juices and acidic beverages in the food industry. Antimicrobial peptides (AMPs) are considered an alternative strategy to control the growth of this spoilage microorganism in acidic beverages. AMPs can be used alone or in combination with other antimicrobials to enhance the shelf-life of foods. In this study, the antibacterial effect of bovicin HC5 and ɛ-polylysine were evaluated individually and in combination against vegetative cells and germinated endospores of A. acidoterrestris DSMZ 2498 grown in AAM broth and orange juice. A significant decrease (P < 0.05) in the microbial growth and specific growth rate, and an increase in lag phase (P < 0.05) of vegetative cells and germinated endospores of A. acidoterrestris DSMZ 2498 were observed with the addition of increasing concentrations of both antimicrobial peptides in AAM broth. Both AMPs exhibited strong inhibition of the target bacterium with a minimum inhibitory concentration (MIC) of 2.50 and 5.00 µg/mL of bovicin HC5, and 7.81 and 7.81 µg/mL of ɛ-polylysine against vegetative cells and germinated endospores of A. acidoterrestris DSMZ 2498, respectively. Further studies showed that bovicin HC5 possessed bactericidal properties having a minimum bactericidal concentration (MBC) of 5.00 µg/mL against vegetative cells and germinated endospores of A. acidoterrestris DSMZ 2498. The antibacterial activity of both AMPs in combination was evaluated using the checkerboard assay. A fractional inhibitory concentration (FIC) index of 1 was obtained against the vegetative cells and germinated endospores of A. acidoterrestris DSMZ 2498 indicating an additive effect between the two AMPs. The AMPs alone and in combination reduced (P < 0.05) the viability of A. acidoterrestris DSMZ 2498 germinated endospores that were inoculated (10 6 CFU/mL) in concentrated orange juice (11 oBx). However, the antimicrobial effect was more pronounced with bovicin HC5 as viable cells and germinated endospores reduced below the detection limit after 36 h of treatment. The exposure time required to kill 90 % of the initial microbial population at 95 oC (D95oC) was used to assess the effect of the AMPs in the thermal reduction of A. acidoterrestris DSMZ 2498 endospores. Concentrations of 80, 160 µg/mL of bovicin HC5, 125, and 250 µg/mL of ɛ-polylysine and their combination respectively were evaluated. Viable spores were evaluated by spread-plating aliquots taken at different time intervals in AAM medium (pH 4). The results showed that the mean D-value without AMPs was 7.68 min at 95 oC. With the addition of ɛ-polylysine into the juice, no significant difference was observed (P > 0.05) while treatment with bovicin HC5 reduced the D-value (P < 0.05) compared to control. This effect was observed with bovicin HC5 alone and in combination with ɛ-polylysine with a D-value reduction of 71.48 % and 68.36 %, respectively. Additionally, the effect of the AMPs on the morphology and cell structure of A. acidoterrestris DSMZ 2498 was evaluated by atomic force microscopy (AFM). The AFM topographical images and cross-sectional images revealed structural changes in the cell morphology of vegetative cells upon a 24 h treatment with 1X and 2X MIC of the AMPs alone and in combination. The findings in this study revealed the potential application of bovicin HC5 and ɛ-polylysine as natural preservatives in hurdle technologies to control A. acidoterrestris and improve the microbiological stability and safety of fruit juices. Keywords: Antimicrobial peptides. Orange juice. Alicyclobacillus acidoterrestris. Thermoacidophilic. Spoilage. Fruit juice preservation

Alicyclobacillus acidoterrestris é uma bactéria termoacidofílica formadora de esporos que pode sobreviver aos procedimentos de pasteurização e causar deterioração de sucos de frutas e bebidas ácidas na indústria alimentícia. Peptídeos antimicrobianos (AMPs) são considerados uma estratégia alternativa para controlar o crescimento desse microrganismo deteriorante em bebidas ácidas. Os AMPs podem ser usados sozinhos ou em combinação com outros antimicrobianos para aumentar a vida útil dos alimentos. Neste estudo, o efeito antibacteriano de bovicina HC5 e ɛ-polilisina foi avaliado individualmente e em combinação contra células vegetativas e endósporos germinados de A. acidoterrestris DSMZ 2498 cultivados em caldo AAM e suco de laranja. Uma diminuição significativa (P < 0,05) no crescimento microbiano e na taxa de crescimento específico e um aumento na fase lag (P < 0,05) de células vegetativas e endosporos germinados de A. acidoterrestris DSMZ 2498 foram observados com a adição de concentrações crescentes de ambos peptídeos antimicrobianos em caldo AAM. Ambos os AMPs exibiram forte inibição da bactéria alvo com uma concentração inibitória mínima (CIM) de 2,50 e 5,00 µg/mL de bovicina HC5, e 7,81 e 7,81 µg/mL de ɛ-polilisina contra células vegetativas e endosporos germinados de A. acidoterrestris DSMZ 2498, respectivamente. Estudos posteriores mostraram que a bovicina HC5 possuía propriedades bactericidas com uma concentração bactericida mínima (MBC) de 5,00 µg/mL contra células vegetativas e endosporos germinados de A. acidoterrestris DSMZ 2498. A atividade antibacteriana de ambos os AMPs em combinação foi avaliada usando o ensaio checkerboard. Um índice de concentração inibitória fracionada (FIC) de 1 foi obtido contra as células vegetativas e endósporos germinados de A. acidoterrestris DSMZ 2498 indicando um efeito aditivo entre os dois AMPs. Os AMPs isoladamente e em combinação reduziram (P < 0,05) a viabilidade de endósporos germinados de A. acidoterrestris DSMZ 2498 inoculados (106 UFC/mL) em suco de laranja concentrado (11 oBx). No entanto, o efeito antimicrobiano foi mais pronunciado com bovicina HC5 como células viáveis e endosporos germinados reduzidos abaixo do limite de detecção após 36 h de tratamento. O tempo de exposição necessário para matar 90 % da população microbiana inicial a 95 oC (D95 oC) foi usado para avaliar o efeito dos AMPs na redução térmica de endósporos de A. acidoterrestris DSMZ 2498. Foram avaliadas as concentrações de 80, 160 µg/mL de bovicina HC5, 125 e 250 µg/mL de ɛ-polilisina e suas combinações, respectivamente. Esporos viáveis foram avaliados por alíquotas espalhadas em diferentes intervalos de tempo em meio AAM (pH 4). Os resultados mostraram que o valor D médio sem AMPs foi de 7,68 min a 95 oC. Com a adição de ɛ-polilisina no suco, nenhuma diferença significativa foi observada (P > 0,05), enquanto o tratamento com bovicina HC5 reduziu o valor D (P < 0,05) em relação ao controle. Este efeito foi observado com bovicina HC5 sozinha e em combinação com ɛ-polilisina com uma redução do valor D de 71,48 % e 68,36 %, respectivamente. Adicionalmente, o efeito dos AMPs na morfologia e estrutura celular de A. acidoterrestris DSMZ 2498 foi avaliado por microscopia de força atômica (AFM). As imagens topográficas AFM e as imagens transversais revelaram mudanças estruturais na morfologia celular de células vegetativas após um tratamento de 24 h com 1X e 2X MIC dos AMPs sozinhos e em combinação. Os resultados deste estudo revelaram a aplicação potencial de bovicina HC5 e ɛ-polilisina como conservantes naturais em tecnologias de barreira para controlar A. acidoterrestris e melhorar a estabilidade microbiológica e a segurança dos sucos de frutas. Palavras-chave: Peptídeos antimicrobianos. Suco de laranja. Alicyclobacillus acidoterrestris. Termoacidofílico. Deterioração. Preservação de suco de frutas