The role of NAD+ compartmentation and dynamics in Arabidopsis thaliana

Abstract

Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) is a fundamental coenzyme required to regulate plant central metabolism and redox status homeostasis. Plants produce NAD+ via de novo and salvage pathways. Despite early steps of the two pathways occur in different subcellular compartments, de novo in chloroplasts and salvage in cytosol, both pathways produce the final product NAD+ exclusively in the cytosol. Thus, NAD+ must be imported into organelles to drive biological processes inside them. In Arabidopsis thaliana, three genes have been identified as NAD+ carriers, namely NDT1 (At2g47490) and NDT2 (At1g25380), both targeted to the inner mitochondrial membrane, and the peroxisomal transporter PXN (At2g39970). The previous functional characterization of NDT1, NDT2 and PXN have revealed their importance for seed production and quality, seedling establishment, photosynthesis, metabolism, stomatal density and stomatal conductance. To extend our knowledge on the importance of NAD+ dynamics, we used mutants for NAD+ transport and focused in comprehend: (1) how altered NAD + distribution affects stomatal development in cotyledons, (2) the crosstalk between NAD+ transport and elevated atmospheric CO2 concentration and (3) NAD + dynamics in vivo under different environmental cues. The results indicate that NAD negatively regulates stomatal development in cotyledons of Arabidopsis. Seedlings with reduced expression of mitochondrial (NDT1 and NDT2) and peroxisomal (PXN) NAD+ transporter genes displayed reduced numbers of stomata lineage cells and reduced stomatal density. Furthermore, cotyledons of wild- type seedlings treated with exogenous NAD+ and cotyledons of mutant plants with reduced NAD+ breakdown capacity also exhibited reduced stomatal number. Impaired NAD+ transport and the exogenous NAD+ feeding were further associated with the induction of abscisic acid (ABA)-responsive genes. Additionally, NAD+ feeding of aba- 2 and ost1 seedlings, impaired in ABA synthesis and ABA signaling, respectively, did not impact on stomatal number, whereas the inhibition of ABA synthesis rescued the stomatal phenotype in NAD+ carrier mutants. Moreover, in vivo measurement of ABA dynamics in seedlings of an ABA-specific optogenetic reporter - ABAleon2.1 treated with NAD+ showed increases in ABA content, suggesting that NAD+ impacts on stomatal development through ABA synthesis and signaling. The results demonstrate that intracellular NAD+ homeostasis is essential for normal stomatal development, and provide a link between central metabolism and developmental plasticity. Posteriorly, NAD+ carrier mutants were grown under elevated CO2 concentrations and overall results showed that, under high CO2 , the mutants displayed reductions in total biomass and leaf number compared to the control under ambient CO2 . Furthermore, higher levels of photorespiratory intermediates such as glutamate and glycine were found in the mutant lines under elevated CO2 . Moreover, mutant lines produced much less seeds than wild-type plants regardless of CO2 concentration, demonstrating that NAD+ compartmentalization is fundamental during reproductive phase in both ambient and high CO2 concentration. With the aim to deeper study NAD + dynamics, we transformed wild-type and a ndt1 mutant line with the Peredox-mCherry sensor that permits the measuring of cytosolic NADH dynamics in vivo. The cytosol of ndt1 mutant lines presented higher levels of NADH/NAD + compared to the control line. Additionally, increased cytosolic levels of NADH/NAD+ in leaves of ndt1 mutants was observed upon the exogenous feeding of sugars and tricarboxylic acid (TCA) cycle intermediates. Surprisingly, light, mitochondrial electron transport chain (mETC) inhibitors and oxygen deprivation treatment did not show significant differences in cytosolic NADH/NAD+ content in ndt1 mutants compared to wild-type. The results provide evidence of disruption of NAD+ balance among organelles in ndt1 mutants and show the power of this technique to follow NADH dynamics in vivo. Collectively, the data presented provide different inputs to show that, not only NAD+ metabolism, but also NAD+ distribution across organelles, are fundamental to drive essential biological processes in plants. Furthermore, this study proposes a direct link between central metabolism and early developmental process such as stomatal development. Keywords: Nicotinamide adenine dinucleotide. NAD+ transport. Metabolism. Development.

Nicotinamide adenina dinucletídeo (NAD+) é uma coenzima fundamental para a regulação do metabolismo central e do estado redox celular. Plantas produzem NAD+ através das vias de novo e salvamento. Apesar de começarem em diferentes compartimentos, de novo nos cloroplastos e salvamento no citosol ambas as vias sintetizam NAD+ como produto final no citosol. Desta forma, o NAD+ precisa ser importado pelas organelas para exercer suas funções no interior das mesmas. Em Arabidopsis três genes foram identificados como transportadores de NAD+ sendo dois localizados na membrana interna da mitocôndria NDT1 (At2g4790) e NDT2 (At1g25380) e um na membrana do peroxissomo PXN (At2g39970). A caracterização funcional dos genes NDT1, NDT2 e PXN revelou a importância a importância desses genes para a produção e qualidade de sementes, estabelecimento de plântulas, fotossíntese, metabolismo e regulação do número de estômatos e condutância estomática. Para aumentar nosso conhecimento sobre a importância das dinâmicas de NAD+, utilizamos mutantes para o transporte de NAD+ e nos focamos em compreender: (1) como a distribuição de NAD+ afeta o desenvolvimento estomático em cotilédones, (2) a interação entre transporte de NAD+ e altas concentrações de gás carbônico e (3) dinâmicas de NAD+ in vivo em diferentes situações ambientais. Os resultados indicam que o NAD+ regula negativamente o desenvolvimento estomático em cotilédones de Arabidopsis. Plântulas com reduzida expressão dos transportadores de NAD+ mitocondriais (NDT1 e NDT2) e do peroxissomo (PXN) apresentaram reduzidos números de células formadoras de estômatos e densidade estomática. Além disso, cotilédones tratados com NAD+ de forma exógena e cotilédones de plantas com reduzida capacidade de mobilização de NAD+ também exibiram menor densidade estomática. O impedimento de transporte de NAD+ e o tratamento exógeno com NAD+ foram associados com a indução de genes responsivos ao hormônio ABA. Adicionalmente, o tratamento de NAD+ em mutantes para a síntese (aba-2) e sinalização (ost1) de ABA não impactou o número de estômatos enquanto o uso de um inibidor da biossíntese de ABA recuperou o fenótipo de estômatos dos mutantes para o transporte de NAD+ . Ademais, a mensuração in vivo das dinâmicas de ABA em plântulas do sensor de ABA (ABA-specific optogenetic repórter – ABAleon2.1) tratadas com NAD+ mostraram aumentos nos níveis de ABA, sugerindo que o NAD+ impacta o número estomático através da síntese e sinalização de ABA. Os resultados demonstraram que a homeostase intracelular de NAD+ é essencial para o correto desenvolvimento estomático e fornece uma ligação entre o metabolismo central e a plasticidade do desenvolvimento. Posteriormente crescemos os mutantes para o transporte de NAD+ em elevadas concentrações de CO2 e em geral os resultados mostraram que as plantas mutantes apresentaram menor biomassa e número de folhas que o controle em altas concentrações de CO2 . Adicionalmente, plantas mutantes acumularam intermediários da fotorrespiração, tais como glutamato e glicina em alto CO2 . Além disso, plantas mutantes produziram muito menos sementes que plantas WT em resposta ao CO2 , demonstrando que a compartimentalização do NAD+ é fundamental durante a fase reprodutiva em condição ambiente e de alto CO2 . Com o objetivo de estudar as dinâmicas de NAD+ transformamos plantas controle e plantas com reduzida expressão do gene NDT1 com o sensor de NAD+ chamado Peredox-mCherry que permite a mensuração da dinâmica de NADH/NAD+ no citosol in vivo. O citosol das plantas mutantes ndt1 apresentaram maiores níveis de NADH/NAD+ comparado com o citosol de plantas controle. Adicionalmente, aumentos nos níveis de NADH/NAD+ em folhas de ndt1 foram observados após o tratamento destas com açúcares e intermediários do ciclo dos ácidos tricarboxílicos. Surpreendentemente, os tratamentos com luz, inibidores da cadeia de transporte mitocondrial e indução de estresse por oxigênio não apresentaram diferenças significativas nos teores de NADH/NAD+ entre mutantes e plantas controle. Os resultados apresentam evidência do desbalanço de NAD+ entre as organelas em plantas mutantes e mostra ainda como essa técnica é valiosa para estudar as dinâmicas de NADH in vivo. Coletivamente, os dados apresentados mostram que não apenas o metabolismo do NAD+ é fundamental para regular processos biológicos essenciais, mas também sua distribuição entre organelas. Além disso, este estudo propõem uma ligação direta entre o metabolismo central e processos iniciais de desenvolvimento como o desenvolvimento estomático. Palavras-chave: Nicotinamida adenina dinucleotídeo. Transporte de NAD+ . Metabolismo. Desenvolvimento.