Estudo da variabilidade e organização de genes que codificam proteínas de superfície de cepas de Staphylococcus aureus associadas à mastite bovina

Abstract

Estudo da variabilidade e organização de genes que codificam proteínas de superfície de cepas de Staphylococcus aureus associadas à mastite bovina. Orientadora: Andréa de Oliveira Barros Ribon. Coorientador: Tiago Antônio de Oliveira Mendes. Staphylococcus aureus é um importante patógeno causador de mastite bovina em rebanhos de gado leiteiro. A doença, que acomete os quartos mamários de vacas leiteiras, é de alta prevalência, difícil tratamento, e pode evoluir para quadros mais graves afetando o bem-estar animal, e reduzindo a rentabilidade dos produtores. A doença pode se manifestar de forma clínica, com sinais inflamatórios sistêmicos visíveis, ou de forma subclínica, sem sintomas aparentes exceto pelo aumento da alta contagem de células somáticas no leite. Diversos estudos têm tentado entender os mecanismos moleculares associados pelos quais cepas de S. aureus, promovem invasão, evasão e modulação do sistema imune de seus hospedeiros. Neste trabalho, foi realizada a comparação de proteínas de superfície e secretadas de cepas de S. aureus visando identificar fatores bacterianos associados à mastite clínica ou subclínica. No Capítulo 1, análises in silico realizadas com as cepas bovinas 302, 170, 1269, 1364, (subclínicas), RF122 e N305 (clínicas) mostraram a alta similaridade em relação ao conteúdo de genes de virulência e reguladores. No entanto, vários polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) não sinônimos foram identificados, especialmente em genes que codificam proteínas envolvidas na evasão imune do hospedeiro e proteínas de superfície. Uma lipoproteína foi identificada como exclusiva de bactérias pertencentes ao grupo clínico. No Capítulo 2, bactérias coletadas em cinco estados brasileiros foram usadas para validar os achados do Capítulo 1. O gene da lipoproteína foi amplificado a partir do DNA total de 108 isolados com um par de primers complementares apenas à sequência encontrada nas cepas clínicas N305 e RF122. Os resultados mostraram um amplicon do tamanho esperado em 34/38 (89,47%) isolados de mastite clínica, e em apenas 3/34 (8,82%) isolados de mastite subclínica. No Capítulo 3, foi estudada a organização do cluster lpl, região do genoma de S. aureus onde se localiza o gene que codifica a lipoproteína identificada no Capítulo 1, visando elucidar os mecanismos com os quais uma lipoproteína de membrana pode interferir na forma como Staphylococcus aureus de manifesta como um patógeno bacteriano de grande importância internacional. Análises in silico mostraram diferenças no C-terminal da lipoproteína, região implicada na internalização bacteriana.Em resumo, este trabalho identificou que, a despeito da alta similaridade no conteúdo gênico de cepas bovinas de S. aureus, existem diferenças em lipoproteínas que podem influenciar o processo de infecção da glândula mamária. Palavras-chave: Staphylococcus aureus. Mastite bovina. Fatores de virulência. Lipoproteína. Cluster lpl.

Staphylococcus aureus is an important pathogen causing bovine mastitis in dairy herds. The disease, which affects the breast quarters of dairy cows, is highly prevalent, difficult to treat, and can progress to more serious conditions, affecting animal welfare, and reducing the profitability of producers. The disease can manifest clinically, with visible systemic inflammatory signs, or subclinically, with no apparent symptoms except for an increase in the high somatic cell count in milk. Several studies have tried to understand the associated molecular mechanisms by which S. aureus strains promote invasion, evasion and modulation of the immune system of their hosts. In this work, a comparison of surface and secreted proteins of S. aureus strains was performed in order to identify bacterial factors associated with clinical or subclinical mastitis. In Chapter 1, in silico analyzes performed with bovine strains 302, 170, 1269, 1364, (subclinical), RF122 and N305 (clinical) showed the high similarity in relation to the content of virulence and regulator genes. However, several non- synonymous single nucleotide polymorphisms (SNPs) have been identified, especially in genes encoding proteins involved in host immune evasion and surface proteins. A lipoprotein was identified as exclusive to bacteria belonging to the clinical group. In Chapter 2, bacteria collected from five Brazilian states were used to validate the findings in Chapter 1. The lipoprotein gene was amplified from the total DNA of 108 isolates with a pair of primers only complementary to the sequence found in clinical strains N305 and RF122. The results showed an amplicon of the expected size in 34/38 (89.47%) isolates from clinical mastitis, and in only 3/34 (8.82%) isolates from subclinical mastitis. In Chapter 3, the organization of the lpl cluster, a region of the S. aureus genome where the lipoprotein identified in Chapter 1 is located, was studied, aiming to elucidate the mechanisms with which a membrane lipoprotein can interfere in the way in which Staphylococcus aureus manifests as a bacterial pathogen of great international importance. In silico analyzes showed differences in the C-terminus of the lipoprotein, a region involved in bacterial internalization. In summary, this work identified that, despite the high similarity in the gene content of S. aureus bovine strains, there are differences in lipoproteins that can influence the process of infection of the mammary gland.Keywords: Staphylococcus aureus. Bovine mastitis. Virulence factors. Lipoprotein. Lpl cluster.