Análise de determinantes virais envolvidos na indução diferencial de sintomas por begomovírus em tomateiro e Nicotiana benthamiana

Abstract

Os vírus pertencentes à família Geminiviridae são caracterizados pelo genoma composto por DNA circular de fita simples, encapsidado em uma partícula icosaédrica geminada. As espécies do gênero Begomovirus possuem grande importância econômica. No Brasil, o tomateiro é infectado por um complexo com pelo menos oito espécies de begomovírus. Dentre estas, o Tomato yellow spot virus (ToYSV) é uma espécie que desperta interesse, pois apesar de ter sido isolado do tomateiro, possui características moleculares e filogenéticas mais semelhantes às de begomovírus isolados de Sida sp. O ToYSV induz sintomas precoces e severos em tomateiro e em Nicotiana benthamiana em comparação a outros begomovírus, como o Tomato rugose mosaic virus (ToRMV). As diferenças na precocidade e na severidade dos sintomas podem ser devidas a um maior grau de adaptação do ToYSV a estes hospedeiros. Os objetivos deste trabalho foram estudar a natureza do relacionamento entre o ToYSV e outros begomovírus, e identificar os determinantes genéticos virais responsáveis pelas indução diferencial de sintomas entre o ToYSV e o ToRMV. O ToYSV não foi capaz de formar pseudo-recombinantes viáveis com nenhum dos begomovírus isolados de Sida. Entre os begomovírus isolados de tomateiro, o ToYSV formou pseudorecombinantes com o ToCrLYV (com o qual apresenta sequência conservada na origem de replicação) e com o TGMV (com o qual não apresenta sequência conservada). Esses resultados indicam que a proteína Rep do TGMV é capaz de reconhecer componentes heterólogos com sequências distintas na origem de replicação, e demonstram que vírus com origem recombinante podem ser mais próximos, em termos de trans-replicação, de vírus com menor relacionamento filogenético, desde que a recombinação ocorra em uma região do genoma não envolvida na replicação viral. Em tomateiro, o acúmulo do ToYSV é inicialmente superior ao do ToRMV, entretanto o acúmulo de ambos os vírus se torna semelhante ao final do ciclo de infecção. Em N. benthamiana o acúmulo do ToYSV é bem superior ao do ToRMV durante toda a infecção. Ensaios de replicação em protoplastos de Nicotiana tabacum demonstraram que ambos os vírus replicam na mesma taxa. Em tomateiro, apenas células dos feixes vasculares apresentaram-se infectadas por ambos os vírus. Já em N. benthamiana o ToYSV foi detectado em células do mesófilo e dos feixes vasculares, enquanto o ToRMV permaneceu restrito ao floema, indicando que maior severidade dos sintomas induzidos pelo ToYSV nesse hospedeiro pode ser resultado de sua capacidade de invadir diferentes tecidos. Em tomateiro não ocorreu sinergismo entre os dois vírus, enquanto em N. benthamiana houve sinergismo, com maior acúmulo de DNA do ToRMV em infecção mista comparada à infecção simples. O sinergismo foi consequência da mudança do tropismo de tecido do ToRMV, que foi capaz de invadir o mesófilo em plantas com infecção mista. Genomas híbridos entre os dois vírus foram construídos e avaliados quanto ao ganho ou perda das características analisadas. Foram construídos dois recombinante recíprocos, o primeiro baseado no ToRMV contendo os genes MP e NSP do ToYSV, e o segundo baseado no ToYSV porém contendo os genes MP e NSP do ToRMV. Em tomateiro, o ToRMV recombinante induziu sintomas e acumulou DNA de forma similar ao ToRMV. Em N. benthamiana o recombinante induziu sintomas mais severos e acumulou mais DNA em relação ao ToRMV, porém os sintomas foram menos severos em relação ao ToYSV. O ToRMV recombinante em N. benthamiana permaneceu restrito ao floema. O ToYSV recombinante, quando inoculado em tomateiro, induziu sintomas mais atenuados e acumulou menos DNA em comparação ao ToYSV, porém os sintomas foram mais severos em relação ao ToRMV. Similarmente, quando inoculado em N. benthamiana induziu sintomas menos severos do que o ToYSV. O ToYSV recombinante foi capaz de invadir e infectar células do mesófilo em N. benthamiana. Os resultados sugerem que os genes MP e NSP estão envolvidos na adaptação do ToYSV ao tomateiro e N. benthamiana, porém outros genes e/ou regiões reguladoras também devem estar envolvidos. Além disso a contribuição dos genes MP e NSP na adaptação de begomovírus é dependente do hospedeiro e do background genético do vírus.

Viruses in the family Geminiviridae are characterized by a single-stranded, circular DNA genome encapsidated in twinned icosahedral particles. Species in the genus Begomovirus have great economical importance. In Brazil, tomato plants are infected by a viral complex comprised of at least eight begomoviruses. Among them, Tomato yellow spot virus (ToYSV) is particularly interesting since, despite having been isolated from tomato, it is closer in terms of phylogeny to begomoviruses from Sida sp. ToYSV induces earlier and more severe symptoms in tomato and Nicotiana benthamiana in comparison with other begomoviruses such as Tomato rugose mosaic virus (ToRMV). These differences could be due to a better adaptation (fitness) of ToYSV to these hosts. The objectives of this work were to analyze the nature of the relationship between ToYSV and other begomoviruses, and to identify the viral genetic determinants responsible for the differential symptom induction between ToYSV and ToRMV. ToYSV was unable to form viable pseudorecombinants with viruses from Sida. Among tomato begomoviruses, ToYSV formed pseudorecombinants with ToCrLYV (which has identical Rep binding sites to ToYSV) and with TGMV (which has different Rep biding sites). These results indicated that the TGMV Rep is versatile in terms of recognizing a heterologous DNA component with distinct Rep binding sites, and demonstrate that viruses with a recombinant origin can be closer in terms of trans-replication to viruses with low sequence identity, as long as the recombination occurred in a region of the genome not involved in replication. In tomato, ToYSV reached a higher concentration than ToRMV at 14 dpi, but both viruses reached similar concentrations at 28 dpi. In N. benthamiana, ToYSV reaches a higher concentration than ToRMV at both time points. Viral replication in protoplasts is similar for both viruses. Both viruses are phloem-restricted in tomato. However, and unlike ToRMV, ToYSV infects mesophyll cells of N. benthamiana, which could explain its higher accumulation and symptom severity in this host. Synergism between the two viruses was observed only in N. benthamiana, as a result of changes in tissue tropism of ToRMV, which became capable of invading the mesophyll. Hybrid viruses were constructed between ToYSV and ToRMV, and were evaluated in terms of gain or loss of function. Two reciprocal recombinants were constructed, one based on ToRMV with the MP and NSP genes from ToYSV, and the other based on ToYSV with the MP and NSP genes from ToRMV. In tomato, the ToRMV-based recombinant behaved similarly to ToRMV in terms of symptom severity and DNA accumulation. In N. benthamiana the recombinant induced more severe symptoms and reached a higher concentration in comparison to ToRMV, but symptoms were less severe in relation to ToYSV. The ToRMV-based recombinant remained phloemrestricted in N. benthamiana. The ToYSV-based recombinant, when inoculated on tomato, induced attenuated symptoms and accumulated less DNA in comparison to ToYSV, however symptoms were more severe in relation to ToRMV. Similarly, when inoculated on N. benthamiana the recombinant induced attenuated symptoms in comparison to ToYSV. The ToYSV-based recombinant was capable of invading mesophyll cells of N. benthamiana. Together, the results indicate that the MP and NSP genes are involved in ToYSV adaptation to tomato and N. benthamiana, but other genes and/or regulatory regions must also be involved. Also, the contribution of the MP and NSP genes in begomovirus host adaptation is host- and virus-specific.