Transcriptoma dual do efeito leishmanicida de inibidores de enzimas modificadoras de histonas na infecção in vitro e estudos de histonas deacetilases de L. braziliensis

Abstract

Leishmaniose cutânea (LC) é a manifestação clínica mais comum entre as leishmanioses, grupo de doenças negligenciadas causadas por parasitos do gênero Leishmania. O Brasil concentra a maior parte dos casos de LC nas Américas, sendo L. (Viannia) braziliensis a espécie mais prevalente. O arsenal terapêutico para o tratamento das leishmanioses é escasso e provoca efeitos colaterais graves, sendo necessário o desenvolvimento de novos medicamentos. As histonas deacetilases (HDACs) e as proteínas arginina metiltransferases (PRMTs) possuem importância para a biologia de diferentes células, incluindo parasitos, pois atuam na epigenética afetando a regulação da expressão gênica e replicação. Por isto vêm sendo apontadas como potenciais alvos farmacológicos. Foram selecionados previamente um inibidor de PRMT (BSF2) e um inibidor de HDAC (TH85) com ação leishmanicida contra L. braziliensis na infecção de macrófagos. Como forma de avaliar potenciais mecanismos de ação, neste trabalho foi realizada a montagem e a análise de RNA-Seq dual de macrófagos infectados por L. braziliensis na infecção e tratados com o BSF2 e TH85. O tratamento com o BSF2 levou à modulação negativa da via do TNF em macrófagos, sendo esta via validada por PCR em tempo real. O tratamento com o TH85 não alterou a expressão diferencial de genes de macrófagos ou do parasito, indicando que este inibidor de HDAC pode realmente estar atuando diretamente no parasito, sem influência direta na transcrição gênica global. Complementando este trabalho, apresenta-se dados preliminares da deleção gênica por CRISPR/Cas9 das 4 HDACs de L. braziliensis. A deleção única ou dupla das HDACs parece ter influenciado no crescimento e divisão celular das populações transfectadas. Porém estes dados precisam ser confirmados com clones isolados. Este trabalho também apresenta o depósito de uma patente sobre a aplicação das HDACs de L. braziliensis recombinantes no diagnóstico de leishmaniose. Como conclusão, este trabalho reforça as HDACs e seus inibidores como potenciais aplicações biotecnológicas no desenvolvimento de medicamentos e de estratégias de diagnóstico de leishmaniose causada por L. braziliensis. Palavras-chave: Transcriptoma. Leishmanicida. L. braziliensis.

Cutaneous leishmaniasis (CL) is the most common clinical manifestation among leishmaniasis, a group of neglected diseases caused by parasites of the Leishmania genus. Brazil concentrates most cases of CL in the Americas, with L. (Viannia) braziliensis being the most prevalent species. The therapeutic arsenal for the treatment of leishmaniasis is scarce and causes serious side effects, requiring the development of new drugs. Histone deacetylases (HDACs) and proteins arginine methyltransferases (PRMTs) are important for the biology of different cells, including parasites, as they act in epigenetics, affecting the regulation of gene expression and replication. For this reason, they have been identified as potential pharmacological targets. A PRMT inhibitor (BSF2) and an HDAC inhibitor (TH85) with leishmanicidal action against L. braziliensis in macrophage infection were previously selected. As a way of evaluating potential mechanisms of action, in this work we performed the assembly and analysis of dual RNA-Seq from macrophages infected by L. braziliensis in the infection and treated with BSF2 and TH85. Treatment with BSF2 led to negative modulation of the TNF pathway in macrophages, which was validated by real-time PCR. Treatment with TH85 did not alter the differential expression of macrophage or parasite genes, indicating that this HDAC inhibitor may actually be acting directly on the parasite, without direct influence on global gene transcription. Complementing this work, we present preliminary data on the gene deletion by CRISPR/Cas9 of the 4 HDACs from L. braziliensis. The single or double deletion of HDACs seems to have influenced the growth and cell division of the transfected populations. However, these data need to be confirmed with isolated clones. This work also presents the filing of a patent on the application of recombinant HDACs from L. braziliensis in diagnosis of leishmaniasis. In conclusion, this work reinforces HDACs and their inhibitors as potential biotechnological applications in the development of drugs, and diagnostic strategies for leishmaniasis caused by L. braziliensis. Keywords: Transcriptome. Leishmanicidal. L. braziliensis.