Transferência gênica mediada por espermatozoides bovinos associados a vetores lentivirais

Abstract

Para otimização da produção de embriões bovinos geneticamente modificados (GMs) foi avaliada a possibilidade de produção in vitro (PIV) utilizando espermatozóides como carreadores de vetores lentivirais (VLs), visto que não consta na literatura relatos utilizando essa estratégia em bovinos. Foram avaliados a produção de embriões GMs com o transgene da proteína verde fluorescente (GFP) e posteriormente com o gene do fator IX de coagulação humano (FIX) como modelo de proteína recombinante humana (PRH), devido à importância desta proteína para pacientes com hemofilia B. Foi confirmada a expressão do GFP em células HEK e MDBK, após transdução das partículas, entretanto não foi possível realizar a seleção das células transduzidas. O mesmo resultado foi encontrado em fibroblastos transduzidos com o transgene FIX. A produção in vitro de embriões co-incubados com VLs durante a fertilização in vitro (FIV) prejudicou a taxa de clivagem e consequentemente a de produção de embriões. Já quando a co-incubação ocorreu durante o cultivo in vitro (CIV) não houve diferença estatística (p>0.05) nas taxas de desenvolvimento embrionário entre os tratamentos estudados. Apesar das células do cumulus terem expressado o GFP após incubação com os lentivírus, o mesmo não foi observado nos embriões. Esse resultado foi confirmado a partir da extração do DNA, que demonstrou ausência de inserção dos transgenes do GFP e FIX, o que diferiu de resultados encontrados em estudos similares. Dessa forma, os VLs estudados foram capazes de transfectar as células do cumulus, demonstrando sua eficiência na transdução de células somáticas, entretanto, não houve a produção de embriões geneticamente modificados a partir da co-incubação dos VLs com espermatozóides bovinos. Palavras-chave: Espermatozóides. Vetores lentivirais. Transferência gênica. Proteínas recombinantes humanas

To optimize the production of genetically modified bovine embryos (GMs), the possibility of in vitro production (IVP) using sperm as carriers of lentiviral vectors (LVs) was evaluated, since there are no reports in the literature using this strategy in cattle. The production of GM embryos with the fluorescent green protein transgene (GFP) and later with the human coagulation factor IX (FIX) gene as a model of human recombinant protein (PRH) was evaluated, due to the importance of this protein for patients with hemophilia B. The GFP expression in HEK and MDBK cells was confirmed after particle transduction, however it was not possible to select the transduced cells. The same result was found in fibroblasts transduced with the FIX transgene. The in vitro production of embryos co-incubated with VLs during in vitro fertilization (IVF) impaired the cleavage rate and consequently the embryo production. However, when the co-incubation happened during in vitro culture (IVC), no statistical difference (p>0.05) was presented in the embryonic development rates between the studied treatments. Although cumulus cells expressed GFP after incubation with lentiviruses, the same was not observed in embryos. This result was confirmed by DNA extraction, which demonstrated the absence of GFP and FIX transgenes insertion, which differed from results found in similar studies. Hence, the studied VLs were able to transfect the cumulus cells, demonstrating their efficiency in the transduction of somatic cells, however, there was no production of genetically modified embryos from the co-incubation of the VLs with bovine sperm. Keywords: Spermatozoa. Lentiviral vectors. Gene transfer. Human recombinant proteins