Micobiota do feijoeiro-comum e pectinases de Colletotrichum lindemuthianum

Abstract

Tanto micro-organismos endofíticos como fitopatogênicos são capazes de colonizar o feijoeiro-comum (Phaseolus vulgaris). Muitos micro-organismos endofíticos são conhecidos por beneficiarem a planta hospedeira. Para identificar esses micro- organismos, um dos métodos utilizados é o sequenciamento de alto rendimento. Alguns micro-organismos também podem prejudicar as plantas hospedeiras, como o fungo fitopatogênico Colletotrichum lindemuthianum. Esse fungo é responsável por causar antracnose no feijoeiro-comum, ocasionando perdas na produtividade dessa cultura. Nos fungos fitopatogênicos, as enzimas que degradam a pectina presente no tecido vegetal são consideradas importantes fatores de virulência. Os principais objetivos desse trabalho foram determinar a micobiota de três variedades de feijoeiro- comum; identificar e analisar genes que codificam pectinases em C. lindemuthianum; inativar por meio da transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (ATMT) e caracterizar funcionalmente genes que codificam pectinases. Ao analisar a micobiota endofítica do feijoeiro-comum foi observado que a diversidade de fungos variou mais entre os órgãos da planta do que entre as variedades. Foram identificados 283 gêneros, distribuídos entre as variedades. Em cada órgão da planta e na rizosfera foram identificados diferentes números de gêneros. Foi encontrado um maior número de interações positivas nos órgãos da parte aérea em todas as variedades. Para conhecer as pectinases produzidas por C. lindemuthianum, os genes que codificam pectinases foram identificados e analisados. O fungo C. lindemuthianum possui 58 genes que codificam para pelo menos seis tipos de enzimas envolvidas na degradação da pectina. Esses genes apresentam em sua região promotora sítios de ligação para diferentes fatores transcricionais. O número de introns foi variável entre os genes. Quarenta e cinco porcento dos genes são diferencialmente expressos em algum momento na interação com o seu hospedeiro. As pectinases putativas apresentaram sítios para N-glicosilação, presença de peptídeo sinal e diferentes pontos isoelétricos. Foram obtidos de 35 a 56 transformantes para cada gene em condições iguais de transformação. Todos os transformantes analisados apresentaram uma única cópia do cassete de deleção. Foram obtidos dois mutantes para o gene pecCl6 (pectato lisase 6 de C. lindemuthianum). Os mutantes ∆pecCl6 obtidos não apresentaram diferença de morfologia, crescimento, esporulação e patogenicidade em relação ao selvagem. Neste trabalho foi observado que a diversidade de fungos endofíticos pode ser acessada de forma eficiente com o sequenciamento de amplicons ITS e que essa diversidade pode variar entre órgãos vegetais distintos e a rizosfera de uma única variedade de planta. Também foi constatada a presença de maior quantidade e diversidade de genes que codificam pectinases em C. lindemuthianum do que o encontrado em outros fitopatógenos, o que sugere que pelo menos parte destas pectinases devem ser importantes para a patogenicidade do fungo C. lindemuthianum. Além disso, foi demonstrado que o sistema ATMT pode ser utilizado para deleção de genes em C. lindemuthianum. Palavras-chave: Microrganismos endofíticos. Sequenciamento de amplicons ITS. Antracnose. Enzimas pectinolíticas. Transformação de fungo.

Both endophytic and phytopathogenic microorganisms are capable of colonizing the common bean (Phaseolus vulgaris). Many endophytic microorganisms are known to benefit the host plant. To identify these microorganisms, one of the methods used is high-throughput sequencing. Some microorganisms can also harm host plants, such as the phytopathogenic fungus Colletotrichum lindemuthianum. This fungus is responsible for causing anthracnose in the common bean, causing losses in the productivity of this crop. In phytopathogenic fungi, enzymes that degrade the pectin present in plant tissue are considered to be important virulence factors. The main objectives of this work were to determine the mycobiota of three common bean varieties; identify and analyze genes that encode pectinases in C. lindemuthianum; inactivate and functionally characterize genes that encode pectinases using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. When analyzing the endophytic mycobiota of the common bean, it was observed that the diversity of fungi varied more between the organs of the plant than between the varieties. A total of 283 genera were identified, distributed among the varieties. Different numbers of genera were identified in each organ and rhizosphere. A greater number of positive interactions were found in the aerial part organs in all varieties. To know the pectinases produced by C. lindemuthianum, the genes that encode pectinases were identified and analyzed. The fungus C. lindemuthianum has 58 genes that code for at least six types of enzymes involved in the degradation of pectin. These genes have binding sites for different transcriptional factors in their promoter region. The number of introns varied between genes. Forty-five percent of the genes are differentially expressed at some point in the interaction with their host. The putative pectinases showed sites for N-glycosylation, the presence of signal peptide, and different isoelectric points. For the functional study of genes encoding pectinases in C. lindemuthianum, the transformation technique mediated by Agrobacterium tumefaciens was used. Thirty-five to 56 transformants were obtained for each gene under equal conditions of transformation. All analyzed transformants presented a single copy of the cassette. Two mutants for the pecCl6 gene were obtained (C. lindemuthianum pectate lyase 6). The ∆pecCl6 mutants obtained showed no difference in morphology, growth, sporulation, and pathogenicity compared to the wild. In this work, it was observed that the diversity of endophytic fungi can be accessed efficiently with the sequencing of ITS amplicons and that this diversity can vary between different plant organs and the rhizosphere of a single plant variety. The presence of a greater quantity and diversity of genes encoding pectinases in C. lindemuthianum was also found than that found in other phytopathogens, which suggests that at least part of these pectinases must be important for the pathogenicity of the fungus C. lindemuthianum. Also, it has been shown that the ATMT system can be used to delete genes in C. lindemuthianum. Keywords: Endophytic microorganisms. ITS amplicon sequencing. Anthracnose. Pectinolytic enzymes. Fungal transformation.