Fotoautotrofia e ozonização de biorreatores na micropropagação de clones de Eucalyptus spp.

Abstract

Os avanços do melhoramento genético e da biotecnologia florestal estão acompanhados por mudanças e desafios na clonagem plantas. Durante muitos anos o uso da miniestaquia tem sido o método de clonagem mais utilizado pelo setor florestal. Porém, o uso do cultivo in vitro vem tornando-se, cada ano, mais importante. As dificuldades apresentadas pelo processo ex vitro de produção de mudas, aumenta a necessidade de protocolos e sistemas eficientes de propagação em laboratório. Com isso, muitos conceitos do cultivo in vitro convencional como meio de cultivo, tipo de recipiente, sistema de produção, heterotrofia estão mudando. Os estudos relacionados aos sistemas fotoautotróficos, jardins clonais in vitro e a automatização dos sistemas vem crescendo e sendo fundamental para o futuro da clonagem de plantas. Estes buscam tornar mais acessível e eficiente o processo de produção de plantas in vitro. Assim, objetiva-se nesse trabalho avaliar o potencial de sistemas fotoautotrófico, a seleção de materiais com maior competência a micropropagação e o uso da esterilização com ozônio na produção de Eucayptus spp. em biorreatores. Analisou-se o uso do meio semi-sólido e líquido, buscando entender o crescimento de clones de Eucalyptus spp. em sistemas de meio líquido como os utilizados em biorreatores. Foi verificado no estudo que o uso de meio líquido proporcionou maior incremento de massas fresca e seca dos explantes, taxa de multiplicação e tamanho da maior brotação. Além das diferenças constatadas no crescimento do material, observou-se respostas diferenciadas entre os clones em relação ao meio de cultivo utilizado (semi-sólido e líquido) para a maioria das características mensuradas. Para avaliação do crescimento de genótipos de Eucalyptus spp., em ambientes de trocas gasosas quanto a multiplicação e alongamento in vitro, testou-se dois ambientes e 10 clones por fase in vitro. O ambiente sem trocas gasosas foi mais favorável para a propagação in vitro dos genótipos testados. Além das diferenças observadas entre ambientes, constatou-se efeito do fator genético sobre as características, o que possibilita a seleção de clones para propagação sob as condições analisadas. Em relação às características avaliadas, os clones de E. benthamii apresentaram melhor desempenho em comparação com os demais clones estudados. Aliados a trocas gasosas, outros fatores como redução de sacarose é luz foram estudados visando estabelecer clones de Eucalyptus spp. em sistemas fotoautotróficos em biorreatores. Todas as qualidades e intensidades lumínicas pesquisadas proporcionaram bom desenvolvimento dos clones de E. benthamii e E. dunnii cultivados in vitro. O uso de LED branca promoveu valores de clorofila total e de carotenoide mais próximos aos encontrados ex vitro para os clones testados. O uso de sacarose, adicionado no meio de cultivo in vitro, foi importante para estimular a produção na multiplicação e alongamento, bem como aumentar as taxas de clorofila total e de carotenoides. Visando sistemas alternativos de esterilização dos biorreatores e meio de cultura, diferentes tempos e concentrações de ozônio (O3) foram utilizados. O O3 pode ser utilizado em substituição à autoclavagem, realizando a ozonização primeiro os biorreatores vazios, com a exposição a 50 mg L-¹ de O3 por 15 min em fluxo constante de 0,5 L min-¹ e, posteriormente, a ozonização do meio de cultura líquido por 90 min com concentração de 50 mg L-¹ de O3 e fluxo de 0,5 L min-¹. Novos estudos devem ser conduzidos buscando optimizar os resultados de multiplicação, alongamento, aclimatação ex vitro, assim como buscar protolocos e tecnologias que aliadas ao ozônio, viabilize econômica e operacionalmente, em larga escala, os biorreatores como estratégia para microjardins clonais.

Advances in genetic improvement and forest biotechnology are lonked to changes and challenges in cloning. For many years the use of mini-cutting has been the method of cloning used by the forestry sector, but the use of in vitro cultivation has become more important each year. The challenges posed by the seedling ex vitro production increase the necessity for efficient protocols and propagation systems in laboratory. With this, many concepts of conventional in vitro culture such as culture medium, container type, production system, heterotrophy are changing. An ever increasing gowth of studies related to photoautotrophic systems applied to in vitro clonal gardens and systems automation has been seen, and becoming instrumental for the future of plant cloning strategies. The objective is to make the in vitro plant production process more accessible and efficient. The aim of this work was to evaluate the potential of photoautotrophic systems, the selection of materials with greater competence in micropropagation and the use of ozone (O3) sterilization on bioreactors-based production of Eucalyptus spp. Solid and liquid media were evaluated in genotypes of Eucalyptus spp., to better understand the growth of this species in liquid medium systems in bioreactors. The use of liquid medium resulted in a greater increase of fresh and dry mass of the explants, multiplication rate and size of the elongated shoots. In addition to the differences observed in the growth of the material, varying responses were observed among the clones regarding the culture medium used (solid and liquid) for most of the characteristics evaluated. Aiming at evaluating if the gas exchange environments favored in vitro growth, multiplication and elongation genotypes of Eucalyptus spp., two environments and 10 clones per phase were tested. In general, the absence of gas exchange was the most favorable environment for the in vitro propagation. In addition to the observed differences between environments, it was verified the effect of the genetic factor on the characteristics, which allows the selection of clones for propagation under the conditions analyzed. Eucalyptus benthamii clones reached better performance compared to the other clones studied. In addition to gas exchange, other factors such as reduction of sucrose and light were studied in order to establish clones of Eucalyptus spp.grown under photoautotrophic conditions in bioreactors. According to the results, Eucalyptus benthamii and E. dunnii clones had good development in all light qualities and intensities tested. The use of white LED promoted values of total chlorophyll and carotenoid closer to those found ex vitro. The use of sucrose in the in vitro culture medium was important to stimulate production in multiplication and elongation, as well as increase the rates of total chlorophyll and carotenoids. Aiming at alternative systems of sterilization of bioreactors and culture medium, different times and concentrations of ozone (O3) were tested. It has been found that, ozone can be used to replace autoclaving, first ozonization of empty bioreactors with exposure to 50 mg L-¹ of O3 for 15 minutes at a constant flow of 0.5 L min-¹ and subsequent to ozonization of liquid culture medium for 90 min with concentration of 50 mg L-¹ O3 and flow of 0.5 L-¹ min. Further studies should be conducted to optimize the results for multiplication, elongation, ex vitro acclimatization, as well as to search for protolocos and technologies that used with O3 sterelization, improve economically and operationally bioreactors as a strategy for mini-clonal hedge.