Molecular, biochemical and microscopic aspects of the cassava-Xanthomonas anoxopodis pv. manihotis interaction

Abstract

Cassava (Manihot esculenta), cultivated essentially in tropical and subtropical regions, is the fourth most important food crop in the world.. Cassava bacterial blight (CBB) caused Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam) is one of the most important cassava diseases, causing yield losses that can reach 100%. However, information about the molecular and biochemical mechanisms involved in Xam-cassava interaction as well as its vascular translocation inside cassava vessels is still limited. To get insight into the mechanisms involved in the defense response of the susceptible and resistant cassava cultivars, Cacau and Fécula Branca, respectively, against Xam, were analyzed the activities of the defense-related proteins peroxidase (POX), polyphenol oxidase (PPO), catalase (CAT), β,1-3- glucanase (GLU), chitinase (CHI), and phenylalanine ammonialyase (PAL), including the accumulation of hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), and malondialdehyde (MDA). Using RT-qPCR, the expression profile of the defense-related genes peroxidase (POX 72), catalase (CAT2), β,1-3- glucanase (GLU), chitinase (CHI), pathogenesis related protein 5 osmotin (PR-5), ethylene ERF2 (ET) and CC-NBS-LRR like protein (CC) was studied. In addition, the vascular translocation of Xam was analyzed by confocal laser scanning microscopy using a GFP-tagged isolate. CCB incidence and Xam population was significantly lower on Fécula-branca when compared to Cacau. POX, PPO and GLU activities were detected 24 hours after inoculation (hai) in Fécula-branca. In contrast, activity on Cacau could be detected only about 72 hai. In addition, PAL, CHI, and CAT activity was higher in Fécula-branca. The MDA concentration did not show any correlation with the disease progress and the H 2 O 2 concentration presented a peak at 120 hai exactly at the decrease of bacterial growth. Based on RT-qPCR, POX, GLU, and PR-5 expression was detected earlier on the resistant cultivar (24 hai) in contrast to the susceptible one (72 hai for POX and GLU; 120 hai for PR-5). ET, CAT, and CHI expression was higher on Fécula Branca and CC expression did not show any response. Xam-GFP vascular translocation could be detected at 6 cm downstream and upstream on cassava stems. Altogether, these results show that a more efficient cassava defense response based on the activity and expression of defense-related proteins and genes, respectively, limited bacterial growth thus contributing to cassava resistance to CBB.

A mandioca (Manihot esculenta) é cultivada essencialmente nas regiões tropicais e subtropicais e é a quarta cultura alimentar mais importante do mundo. A bacteriose da mandioca, causada pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. manihotis é umas das mais importantes doenças da mandioca, podendo causar perdas de até 100% na produção. Entretanto, informações sobre mecanismos bioquímicos e moleculares envolvendo a interação Xam-mandioca, bem como a translocação vascular no interior dos vasos da planta ainda é limitado. Com o objetivo de entender os mecanismos envolvidos nas respostas de defesa da planta contra Xam, cultivares de mandioca, Cacau e Fécula Branca, suscetível e resistente, respectivamente foram usados nas análises das enzimas de defesa, peroxidase (POX), polifenoloxidase (PPO), catalase (CAT), β,1-3- glucanase (GLU), quitinase (CHI) e fenilalanina anônioliase (PAL), bem como na acumulação de peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ) e aldeído malônico (MDA). Usando o RT-qPCR, o perfil da expressão dos genes relacionados com defesa, peroxidase (POX72), catalase (CAT2), β,1-3- glucanase (GLU), qhitinase (CHI), proteína relacionada a patogênese 5 osmotina (PR-5), etileno ERF2 (ET) e proteína CC-NBS- LRR (CC) foram estudados. Adicionalmente, a translocação vascular de Xam foi analisada por microscopia confocal, usando um isolado marcado com GFP. A incidência da bacteriose e a população de Xam foram significativamente menores no cultivar Fécula Branca quando comparado com Cacau. As atividades da POX, PPO e GLU foram detectadas 24 horas após a inoculação (hai) em Fécula Branca. Em contraste, a atividade em Cacau foi detectada apenas ás 72 hai. Adicionalmente, as atividades da PAL, CHI e CAT foram maiores em Fécula Branca. A concentração de MDA não mostrou nenhuma correlação com o progresso da doença e a concentração de H 2 O 2 apresentou um pico ás 120 hai, exatamente no decréscimo do crescimento bacteriano. Baseado no RT-qPCR as expressões de POX, GLU e PR-5 foram detectadas mais cedo no cultivar resistente (24 hai), em contraste com o susceptível (72 hai para POX e GLU e 120 hai para PR-5). As expressões de ET, CAT e CHI foram maiores em Fécula Branca e a expressão de CC não apresentou nenhuma resposta nos tempos de coleta. A translocação de Xam-GFP pode ser detectada aos 6 cm para baixo e para cima nos caules de mandioca. Em conjunto, estes resultados mostram que uma resposta mais eficiente de defesa da mandioca baseada na atividade e expressão de proteínas relacionadas com defesa e genes respectivamente, limitou o crescimento bacteriano e contribuíram para resistência da mandioca à bacteriose.