Sistema imune de insetos: caracterização de inibidores de proteases do tipo SERPIN e análise proteômica da hemolinfa de lagarta da soja (Anticarsia gemmatalis)

Abstract

Anticarsia gemmatalis, Hübner, 1818 (lepidóptera Noctuidae) em condições de estresse, gera três fenótipos com diferentes níveis de melanização na cutícula acompanhada da diminuição da imunidade. Seu sistema imune inato está composto por diversas proteínas responsáveis por ativar e executar a resposta imunológica. Entre estas proteínas, encontram-se proteases e inibidores de proteases, que coordenam tal resposta. Os inibidores encontram-se livremente na hemolinfa ou associados com o corpo gorduroso. Em A. gemmatalis ainda não foi determinado como o estresse afeta as proteínas que circulam na hemolinfa, tampouco sobre a presença ou a função dos inibidores de proteases presentes nela. Por isso o intuito deste trabalho foi perceber o efeito do estresse populacional e do dano mecânico nas proteínas secretadas na hemolinfa das lagartas de A. gemmatalis e identificar inibidores de serino e cisteíno proteases presentes. Em lagartas com e sem estresse abiótico, foi obtida as proteínas da hemolinfa e analisadas em géis 2-DE. Foram feitas duas cromatografias (afinidade e troca iônica), caracterizando e determinando a atividade inibitória. Foi observada uma diminuição de proteínas na hemolinfa das lagartas com ou sem estresse por população após do ferimento. Mas não apresentaram diferenças os perfis dos mapas das proteínas. Também foi encontrado pelo menos dois inibidores de proteases de aproximadamente 38±2 kDa e 90±9 kDa, com uma afinidade de 29,4 vezes maior para as proteases intestinais do próprio inseto do que para as proteases de mamíferos. O mecanismo de inibição foi competitivo e imcompetitivo para as serino e as cisteíno proteases respectivamente. Estes resultados abrem uma nova alternativa na procura de peptídeos para ser utilizados como ferramentas para o controle deste inseto.

Anticarsia gemmatalis, Hübner, 1818 (Lepidóptera Noctuidae) en condiciones de estrés, presenta tres fenotipos con diferentes grados de melanización en su cutícula, acompañada de disminución de la inmunidad. Su sistema inmune innato está compuesto por diversas proteínas responsables por activar e ejecutar la respuesta inmunológica. Entre estas proteínas, se encuentran proteasas e inhibidores de proteasas. Los inhibidores se encuentran libremente en la hemolinfa o asociados al cuerpo graso. En A. gemmatalis no fue determinada aún como el estrés afecta las proteínas que circulan en la hemolinfa ni la presencia o la función de los inhibidores de proteasas. Por eso el propósito de este trabajo fue identificar el efecto del estrés poblacional y del daño mecánico en las proteínas secretadas en la hemolinfa de estas larvas, así como, identificar inhibidores de serína y cisteína proteasas. Las proteínas de la hemolinfa de larvas con y sin estrés abiótico, fueron analizadas en geles 2-DE. Se realizaron dos cromatografías (una de afinidad e otra de troca iónica), para caracterizar y determinar la actividad inhibitoria. Se observó una disminución de proteínas en la hemolinfa de las larvas con y sin estrés por súper población después de ser heridas, mas los mapas de los perfiles de las proteínas no tuvieron diferencias. También fue encontrado por lo menos dos inhibidores de proteasas de aproximadamente 38±2 kDa y 90±9 kDa, con una afinidad de 29,4 veces mayor para las proteasas intestinales del propio insecto que para las proteasas de mamíferos. El mecanismo de inhibición fue competitivo e incopetitivo para serina y cisteína proteasas respectivamente. Estos resultados abren una alternativa en la búsqueda de péptidos para ser utilizados como herramienta para el control de este insecto.

Anticarsia gemmatalis, Hübner, 1818 (Lepidóptera Noctuidae) in stress conditions, they generates three phenotypes with different levels on cuticle melanization follow by loss immunity. Your innate immune system is composed of various proteins responsible for enable and run the immune response. Between these proteins, are proteases and proteases inhibitors that coordinate it response. The inhibitors are free in hemolymph or associate whit fab body. In A. gemmatalis has not yet been determined how of stress affect the proteins that circulate in the hemolymph, nor on the presence or the function of protease inhibitors present in it. The aim of this study was understand the effect of population stress and the mechanical damage in the secreted proteins in hemolymph of caterpillars of A. gemmatalis and identify present inhibitors of serino and cisteíno proteases. In caterpillars with and without abiotic stress, hemolymph proteins was obtained and analyzed in 2-DE gels. Were made two chromatograms (affinity and ionic changes), characterizing and determining the inhibitory activity. Was see loss of protein in hemolymph from caterpillars with and without population stress after injury. But don’t have changes the profiles from proteins maps. It has also been found at least two protease inhibitors of approximately 38±2 kDa e 90±9, with 29,4 more affinity intestinal proteases self than mammalian proteases. The mechanism inhibition was competitive and incompetitive for serine and cysteine proteases respectively. These results open a new alternative in the search for peptides to be used as tools for this insect control.