Comunicação cruzada entre o receptor antiviral NIK1 e imunidade antibacteriana em plantas

Abstract

NIK1 (NSP Interacting kinase I) é um receptor cinase da família das LRRII-RLKs (leucine rich repeat II – receptor like kinase), identificado como alvo de virulência da proteína NSP (Nuclear Shuttle Protein), sendo o principal mediador de uma via de resposta imune contra esse grupo de vírus de DNA. Aufosforilação, de NIK1 em um resíduo de treonina 474 aciona a via de resposta antiviral que culmina com a repressão da expressão de proteínas ribossomais levando à redução da síntese de proteínas da célula vegetal e virais. Apesar de sua atividade antiviral, o transcriptoma de plantas nocautes de nik1 indicam um possível envolvimento de NIK1 como regulador negativo na resposta imune contra bactérias. Com a finalidade de esclarecer o envolvimento de NIK1 na imunidade inata antibacteriana, foram conduzidos ensaios de fosforilação in vitro de NIK1, utilizando os receptores, que intermedeiam PTI (Pamp-triggered immunity), BAK1 ( Brassinosteroid insensitive 1- associated kinase) e FLS2 (Flagellin sensitive – 2). Os resultados de espectrometria de massas demonstraram que BAK1 é um possível regulador da fosforilação de NIK1, uma vez que foi capaz de fosforilar um peptídeo sintético em uma treonina correspondente à posição 474 de NIK1 e de modificar a taxa de autofosforilação desse receptor em um ensaio contendo o domínio cinase intacto de NIK1. Além disso, foi demonstrado por BiFC (complementação de fluorescência bimolecular) que NIK1 e NIK1-T474D interagem tanto com BAK1 quanto com FLS2 na membrana plasmática. Ensaios de co-imunoprecipitação (Co-IP) demonstraram que flagelina promove a dissociação de NIK1 dos receptores para formar o complexo imune ativo BAK1-FLS2. Finalmente, ensaios de Co-IP com linhagens transgênicas de Arabidopsis superexpressando NIK1 e nocautes de nik1 indicaram que NIK1 interfere com a formação do complexo BAK1/FLS2 na resposta antibacteriana, já que a superexpressão de NIK1 diminui a eficiência de formação do complexo imune na presença de flagelina, enquanto que a inativação de NIK1 resulta em efeito oposto. Coletivamente, estes resultados substanciam o argumento de que NIK1 atua regulando negativamente PTI em plantas.

NIK1 (NSP Interacting kinase I), which was first identified as a virulence target of NSP (Nuclear Shuttle Protein), is a receptor-like kinase belonging to the LRRII-RLKs (leucine rich repeat II – receptor like kinase) family and the major mediator of an immune response against this group of DNA virus. NIK1 autophosphorylation at Thr 474 triggers an antiviral response which culminates with the repression of ribosomal protein gene expression leading to suppression of host and viral protein synthesis. Despite its antiviral activity, the transcriptome of nik1 knockouts implicates NIK1 as a possible negative regulator of the immune response against bacteria. To examine the NIK1 involvement in antibacterial innate immunity, in vitro phosphorylation assays were carried out on NIK1, using the PTI (Pamp-triggered immunity)-mediated receptors, BAK1 ( Brassinosteroid insensitive 1- associated kinase) and FLS2 (Flagellin sensitive – 2). The results from mass spectrometry demonstrated that BAK1 may be a regulator of NIK1 phosphorylation, as it was capable of phosphorylating a Thr residue of a synthetic peptide corresponding to the position 474 of NIK1 and modifying the autophosphorylation rate of the NIK1 Kinase domain. Furthermore, BiFC (bimolecular fluorescence complementation) assays demonstrated that NIK1 and NIK1-T474D interact with BAK1 and FLS2 in the plasma membrane. Co-immunoprecipitation (Co-IP) assays showed that flagellin promoted the NIK1 dissociation from BAK1 and FLS2 to form an active BAK1-FLS2 immune complex. Finally, Co-IPs using NIK1- overexpressing transgenic lines and nik1 knockouts indicated that NIK1 interferes with BAK1-FLS2 complex formation in the antibacterial response, as NIK1 overexpression decreased the efficiency of the immune complex formation in the presence of flagellin, whereas NIK1 inactivation resulted in opposing effects. Collectively, these results substantiate the argument that NIK1 regulates negatively plant PTI.