Identificação de fatores transcricionais que controlam a expressão do gene sbMATE

Abstract

O gene SbMATE, que confere tolerância a alumínio em sorgo, é altamente expresso no ápice da radícula e codifica um transportador de membrana pertencente à família MATE (multi drug and toxic compound extrusion family) que é responsável pelo efluxo de citrato ativado por alumínio. A identificação de elementos cis-regulatórios no promotor do gene SbMATE que confere tolerância ao alumínio e de fatores transcricionais que controlam a expressão do referido gene constituem etapas fundamentais para o entendimento do mecanismo de resistência a Al mediado por SbMATE. O objetivo do presente trabalho foi a identificação e caracterização de fatores transcricionais que interagem de uma maneira específica com o promotor para controlar a expressão do gene SbMATE. Entre 22 possíveis fatores transcricionais mapeados em um eQTL que influencia a expressão de SbMATE, quatro deles, NF-YB-Like (Sorbic.009g166200), WRKY-like (Sorbic.009g174300), ZincFinger-like (Sorbic.009g151400) e SORBIDRAFT_09g022540, foram selecionados para análise de atividade de regulação de transcrição específica de promotores. Ensaios de mono-híbrido em leveduras demonstraram que a proteína WRKY41-like, mas não NFY-like, interage com o promotor SbMATE isolado tanto de linhagens tolerantes quanto de susceptíveis. A interação ocorre na região proximal (posição -2102 ao ATG) comum a todos os promotores SbMATE testados. Estes resultados foram confirmados em ensaios de transativação de promotores fusionados a GUS em protoplastos de Arabidopsis. Para isso, Arabidopis thaliana ecotipo Col-0 foi inicialmente transformada com construções de DNA, contendo a região proximal ou de fragmentos truncados do promotor SbMATE fusionados à GUS. As folhas das linhagens transgênicas foram utilizadas para o preparo de protoplastos para expressão transiente dos quatro transfatores selecionados. Tanto WRKY-like quanto ZincFinger-like transativaram especificamente o promotor de SbMATE, enquanto que NF-YB-like e SORBIDRAFT_09g022540 não foram capazes de ativar a expressão do gene repórter. Por meio de ensaios de deleção do promotor, os sítios de interação de WRKY-like e ZincFinger- like foram mapeados em um domínio cis-regulatório de 127 pb, delimitado pelas posições -2102 a -1975 no promotor SbMATE. Coletivamente, estes resultados indicam que os transfatores WRKY-like e ZincFinger-like estão envolvidos no controle da expressão do gene SbMATE.

The SbMATE gene, which confers tolerance aluminum in sorghum, is highly expressed at radicle apex and encodes a membrane transporter belonging to the family MATE (multi drug and toxic compound extrusion family) that is responsible for the efflux of citrate activated by aluminum. The identification of cis-regulatory elements in SbMATE gene promoter that confer tolerance to aluminum and transcription factors that control the expression of such gene are key steps for understanding the SbMATE- mediated resistance mechanism.. The objective of this study was the identification and characterization of transcription factors that interact specifically with the promoter to control the expression of the gene SbMATE. Among 22 transcriptional factors mapped in a eQTL that influences the expression of SbMATE, four of them, NF-YB-Like (Sorbic.009g166200), WRKY-like (Sorbic.009g174300), ZincFinger-like (Sorbic.009g151400) and SORBIDRAFT_09g022540 were selected for analysis of transcriptional regularion activity of specific promoters. Mono-hybrid assays in yeast demonstrated that the WRKY41-like protein, but not NFY-like, interacts with the promoter SbMATE isolated from both tolerant and susceptible varieties. The interaction occured in the proximal region (position -2102 to the ATG) common to all SbMATE promoters tested. These results were confirmed in transactivation assays of GUS-fused promoters in Arabidopsis protoplasts. For this, Arabidopsis thaliana ecotype Col-0 was initially transformed with DNA constructs, containing the proximal region or truncated fragments of the SbMATE promoter fused to GUS. The leaves of transgenic lines were used for the preparation of protoplasts for transient expression of the four selected transfactors. Both WRKY-like and ZincFinger-like transactivated specifically the SbMATE promoter, while NF-YB-like and SORBIDRAFT_09g022540 were unable to activate the expression of the reporter gene. Through promoter deletion assays, WRKY-like interaction and ZincFinger-like sites were mapped in a cis-regulatory domain of 127 bp, delimited by positions -2102 to -1975 in the SbMATE promoter. Collectively, these results indicate that the WRKY-like and ZincFinger- like transfactors are involved in the control of the SbMATE gene expresssion.