Isolamento e caracterização de sequências homólogas a genes de resposta à resistência a doenças em soja

Abstract

A análise do genoma de variedades de soja por hibridização com sondas RFLP (Random Fragment Length Polymorphism) revelou um grande número de bandas monomórficas e de algumas bandas polimórficas de pequeno número de cópias, sendo estas últimas utilizadas normalmente na construção de mapas de ligação. Dentre as sondas que apresentaram polimorfismo, algumas revelaram um grande número de bandas de DNA que eram altamente polimórficas entre diferentes cultivares, mapeando regiões hipervariáveis do genoma. Neste presente trabalho um fragmento de 295 pb (A5309-295), oriundo da amplificação de uma destas sondas (A53-09) com “primers” específicos e que apresenta homologia com genes de resistência a doenças em plantas, foi utilizado para escrutinar uma biblioteca de cDNA de soja. Quatro clones positivos foram obtidos e denominados A5309-28, A5309-41, A5309-48 e A5309-54 foram isolados. Estes clones, com 1,4, 1,7, 2,0 e 1,6 kb, respectivamente, foram seqüenciados e as seqüências de aminoácidos predita de cada um dos clones foram comparadas com outras depositadas no “GenBanK”. O clone A5309-28 apresentou homologia com uma proteína de interação com bomba de prótons de Arabidopsis viiithaliana, e poderia atuar na resposta de defesa das plantas. Durante a resposta de defesa estas enzimas mediam o influxo de prótons através da membrana após a elicitação celular, levando à alcalinização do meio extracelular e acidificação do citosol. Estes são passos importantes durante a durante a resposta de defesa. O clone A5309- 41 apresentou homologia com um transportador de membrana dependente de ATP (transportador ABC) de Populus nigra. Estes transportadores estão freqüentemente envolvidos nos processos de detoxificação durante a resposta de resistência. O clone A5309-48 apresentou homologia com uma proteína lipoxigenase expressa em folhas de tabaco após indução por jasmonato, e poderia participar na resposta de resistência por gerar moléculas sinalizadoras como ácido jasmônico, metil-jasmonato ou peróxidos lipídicos, oriundas da peroxidação lipídica, ou ainda pela formação de metabólitos secundários que podem inibir a proliferação do patógeno. O clone A5309-54 apresentou homologia com a proteína cinase PK12, membro da família LAMMER cinases, expressa em folhas de tabaco após indução por etileno. Para determinar se os quatro clones são expressos, “primers” que flanqueiam regiões específicas de cada clone foram construídos e utilizados em um RT-PCR (reverse transcription PCR). Em todos os órgãos analisados (raiz, caule, folha e semente) existem seqüências transcritas similares aos clones isolados neste trabalho. A homologia entre a o fragmento utilizado como sonda (A5309-295) e os quatro clones positivos foi analisada pelo alinhamento entre suas seqüências de nucletídeos. Todos os quatro clones apresentaram homologia superior a 30% quando comparados com a sonda A5309-295. A seqüência predita de aminoácidos do fragmento utilizado como sonda (A5309-295) contém uma ORF de 56 aminoácidos e apresenta dois sítios conservados: um sítio de meristoilação, indicando uma provável localização de membrana, e um sítio de fosforilação por uma proteína cinase caseína II. Todos os clones isolados também apresentam um sítio de fosforilação por uma proteína cinase C e por uma proteína cinase caseína. Exceto o clone A5309-28, todos os outros isolados também apresentam sítio de meristoilação. A5309-28 apresenta ainda uma região rica em lisina, enquanto o clone A5309-48 um domínio transmembrana. A potencial presença de tais domínios nas seqüências preditas de aminoácidos dos clones positivos e do fragmento utilizado como sonda (A5309-295), indica uma provável presença de regiões similares tanto na seqüência ixprotéica, como de DNA, que permitam a interação dessas proteínas com a membrana plasmática, além de justificar o isolamento dos clones do banco de cDNA.

Analysis of the cultivated soybean genome by hybridization with RFLP (Random Fragment Length Polymorphism) probes revealed a great number of monomorphic, and some polymorphic loci, with a low copy number in the genome. The latter can be used for the construction of linkage maps. There is also another class of probes that reveals hypervariable and high copy number regions. In this work a fragment of 295 base pairs (A5309-295), part of probe A53-09, which has been shown to be homologous to plant disease resistance genes, was used to screen a soybean cDNA library. Four positive clones named A5309-28, A5309-41, A5309-48 and A5309-54 were isolated. These clones, with 1.4, 1.7, 2.0, and 1.6 kilobase pairs, respectively, were sequenced and the corresponding deduced amino acid sequences were compared to those deposited in the GenBank. Clone A5309-28 was homologous to a proton ATPase from Arabidopsis thaliana, and it could participate in the defense response in the plant. During the defense response these enzymes mediate the influx of protons across the membrane leading to the alcalinization of the extracellular medium and acidification of the cytosol. These are important steps during the defense response. Clone A5309-41 was homologous to an ATP-dependent membrane transporter (ABC transporter) from Populus nigra. These transporters are often involved in the detoxication process during the resistance response. Clone A5309-48 was homologous to the lipoxygenase (LOX) enzyme which is expressed in tobacco leaves after induction by jasmonate. These enzymes also participate in the resistance response by taking part on a route leading the production of jasmonic acid, methyl jasmonate or lipid peroxides, or by producing secondary metabolites that may inhibit the pathogen proliferation. Clone A5309-54 was homologous to the protein kinase PK12, a member of the LAMMER family, which is expressed in tobacco leaves induced by ethylene. To determine if the four clones isolated were expressed, primers flanking specific parts of each clone were designed and used in reverse transcription PCR (RT-PCR) reactions. In all organs tested (root, stem, leaves, and seeds) expressed sequences were detected. The sequence relationship between the 295 bp fragment (probe A5309-295), and the four positive clones was analyzed and homologies greater than 30% were found. The clone from which the probe A5309-295 was isolated contains an ORF that potentially codes for an amino acid sequence with 56 residues with two conserved sites: one for myristoylation, which is indicative of membrane localization, and a phosphorylation site for protein kinase C and casein kinase. All four clones, with the exception of clone A5309-28, also presented the myristoylation site. In addition, clone A5309-28 presented a lysine rich region, and clone A5309-48 presented a transmembrane domain. The presence of these domains in the predicted amino acid sequences of the positive clones and of probe A5309-295 indicates that these putative proteins can interact with the plasma membrane, and the presence of these common domains could also help to explain why these clones hybridized with this specific probe.