Indução, caracterização e recuperação da culturabilidade de Salmonella no estado viável não cultivável

Abstract

Salmonella é um dos principais micro-organismos implicados nas doenças causadas pela ingestão de alimentos contaminados e, portanto, torna-se necessário assegurar a ausência deste patógeno nos alimentos para garantir a segurança do consumidor. A maioria dos métodos de detecção de Salmonella depende da culturabilidade do patógeno nas condições de laboratório. É sabido que Salmonella pode entrar no estado conhecido como viável não cultivável (VNC) em alimentos ou no ambiente e assim, resistir durante longos períodos de tempo em condições adversas. Durante o estado VNC, a atividade metabólica das células é muito baixa, impossibilitando sua detecção por técnicas de cultivo tradicionais. Isto pode resultar em subestimação ou a não detecção de células viáveis. Considerando a escassez de informações sobre o estado VNC neste patógeno, objetivou-se, neste trabalho, avaliar condições de indução e de recuperação da culturabilidade de Salmonella no estado VNC e caracterizar a morfologia celular neste estado de resistência. A indução das células de Salmonella enterica sorovares Enteritidis e Typhimurium foi feita em solução tampão fosfato de Butterfield adicionado de 0,6 M de NaCl, solução salina (1,2 M de NaCl), ácido peracético (5,66 mg/mL) ou peróxido de hidrogênio (1,2 mg/mL) a 4 ° A culturabilidade foi acompanhada em caldo C. infusão de cérebro e coração (BHI) e a viabilidade celular foi verificada por microscopia de epifluorescência, com uso do kit Live/Dead® e citometria de fluxo. Análises morfológicas foram realizadas por microscopia de força atômica (MFA). Para a recuperação da culturabilidade foram utilizados o meio mínimo de sais (MMS) e o caldo BHI, suplementados com diferentes componentes. As condições de estresse utilizadas induziram a entrada de Salmonella no estado VNC, com variações no período de tempo para indução. Em condições de estresse nutricional e osmótico a entrada no estado VNC ocorreu em períodos acima de 93 dias, mas estas condições favoreceram a manutenção de maior percentagem de células viáveis, com valores acima de 80,9 %. Condições de estresse mais agressivas como o estresse ácido ou oxidativo induziram a entrada em estado VNC em períodos de, no máximo 24 horas, mas resultaram em percentagens de 8,51 % a 45,5 % de células viáveis. As células submetidas aos estresses nutricional e osmótico apresentaram alterações morfológicas, com redução do tamanho e alteração da forma bacilar para cocóide; alterações que não foram evidenciadas quando o estresse ácido ou oxidativo foram utilizados. O meio MMS foi mais eficiente para promover a recuperação da culturabilidade de Salmonella, particularmente quando 1 % de catalase foi incorporada ao meio. Aumento na frequência de recuperação da culturabilidade também foi constatado quando piruvato de sódio e extrato livre de células de Salmonella e Enterobacter cloacae foram adicionados aos meios de cultura. Salmonella Enteritidis demonstrou maior frequência de recuperação da culturabilidade do que Salmonella Typhimurium. Estes resultados confirmam que diferentes condições estressantes induzem Salmonella no estado VNC e que o uso de MMS acrescido de componentes, como a catalase, pode ser uma alternativa para aumentar a recuperação de células de Salmonella em estado VNC. Assim, estes resultados representam importante avanço no entendimento das condições de entrada e saída de Salmonella do estado VNC.

Salmonella is one of the main microorganisms implicated in diseases caused by food and it is necessary to ensure the absence of this pathogen in food for consumer ́s safety. Most of the methods for Salmonella detection relies on the pathogen culturability in laboratory conditions. It is known that Salmonella can be induced in a state known as viable but non culturable (VBNC) in food or in the environment and withstand in this form for long periods. During the VBNC state, the metabolic activity of the cells is very low, making it impossible to detect by traditional cultivation techniques. This may result in underestimation or failure to detect viable cells of this pathogen. Considering the few information about VBNC state in Salmonella, this study aimed to evaluate the induction of VBNC state in this pathogen, the culturability recovery conditions and characterize the cellular morphology in this state of resistance. The induction of Salmonella enterica serovar Enteritidis and Typhimurium to VBNC state was made in Butterfield phosphate buffer (0.6 M), saline solution (1.2 M NaCl), peracetic acid (5.66 mg/mL) or hydrogen peroxide hydrogen (1.2 mg/mL) at 4 ° C. The culturability was accompanied in brain heart infusion broth (BHI) and cell viability checked by epifluorescence microscopy with the Live / Dead® kit and flow cytometry. Morphological analyzes were performed by atomic force microscopy (AFM). For the recovery of culturability, minimal salts medium (MMS) and BHI broth supplemented with different components. All stress conditions used induced Salmonella into VBNC state and, the time for the VBNC state induction varying. In the starvation and osmotic treatment, VBNC state was detected after 93 days of treatment, but these conditions favored the maintenance of a higher percentage of viable cells, with values above 80.9%. More aggressive stress conditions as acid or oxidative stress induced the cells into VBNC state in periods shorter than 24 hours, but resulted in a percentage of 8.51% to 45.5% viable cells. Cells undergoing starvation and osmotic stress showed morphological changes, reducing the size and changing the bacillary form to coccoid but these changes were not apparent when the acid or oxidative stress were used. The medium MMS was more efficient to promote recovery Salmonella culturability, particularly when 1% catalase was incorporated into the medium. Higher frequency of recovery was also observed when sodium pyruvate and cell free extract of Salmonella and Enterobacter cloacae were added to the media. Among the serotypes used, Salmonella Enteritidis showed higher frequency of recovery than Salmonella Typhimurium. These results confirm that different stress conditions can induce Salmonella to enter in the VBNC state, and the use of MMS plus various components, particularly catalase, can be an alternative to ensure the recovery of Salmonella cells and facilitate the detection of the pathogen in food. Thus, these results represent an important advance in the understanding of the conditions of entry and exit of Salmonella VBNC state.