Expressão de citocinas padrão Th1 e Th2 em camundongos C57BL/6 durante infecção de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis

Abstract

Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis (MAP) é o agente etiológico da paratuberculose, uma enfermidade que causa enterite granulomatosa crônica preferencialmente em ruminantes domésticos e silvestres. É considerada uma doença de impacto econômico e social, devido às perdas no rebanho e na saúde humana, uma vez que se têm indícios da possível relação de MAP com a doença de Crohn. Contudo, muito ainda se desconhece sobre o desenvolvimento da patofisiologia e imunopatogênese desta doença, nos locais da infecção. Desse modo, este estudo propôs verificar a resposta de citocinas pró e anti-inflamatórias por meio da técnica de PCR quantitativo e associar a expressão destas citocinas com as lesões e a presença do agente em órgãos de camundongos C57BL/6 infectados por via intraperitoneal com a cepa MAP66115-98. Em 20 camundongos foram aplicados 250μl de inóculo a 3 x 10 8 UFC/ml e, em oito controles foram aplicados PBS. Os animais foram sacrificados aos 30, 60, 90 e 120 dias pós-inoculação. Em cada período, foram coletado baço, fígado, intestino (cólon e íleo) e placas de Peyer de cinco camundongos desafiados e de dois controles. Verificou-se na maioria, uma regulação positiva nos perfis de expressões das citocinas pró-inflamatórias IL-2, IFN-ү e TNF-α, e anti-inflamatórias IL-4 e IL-10 nos órgãos analisados em relação aos controles durante o período do experimento. Observaram-se também regulações negativas na quarta semana no baço e colón, na décima segunda no baço, íleo e placa de Peyer e na décima sexta semana no fígado, colón e íleo. Diferenças estatísticas foram observadas somente na oitava semana após o desafio no fígado para IFN-ү, no baço para expressão da IL-2 e IFN-ү e no íleo para IL-4 e TNF-α. Na quarta semana, foi possível identificar aumento dos níveis de transcritos de RNAm das citocinas estudadas. No fígado, íleo e colón o IFN-ү apresentou maior nível de transcritos de RNAm em relação ao controle negativo, no entanto no baço os maiores níveis foram observados para a IL-10. Somente na oitava semana foi possível observar diferença estatística significativa para a citocina IFN-ү, em amostras do fígado e baço, para o TNF-α e IL-4 no íleo e para a IL-2 no baço. Os maiores níveis de transcrito de RNAm foram observados no fígado, para o IFN-ү , no baço para a IL-2 , no íleo e placa de Peyer para a IL-4 e no colón para a IL-10. Na décima segunda semana, os maiores níveis de transcrito de RNAm foram observados no fígado para a IL-10, no baço e íleo para a IL-2, no colón para o TNF-α e na placa de Peyer para a IL-4. Na décima sexta semana, os maiores níveis de transcrito de RNAm foram observados no fígado e colón para a IL-10, no baço e íleo para o IFN-ү e na placa de Peyer para o TNF-α. Os animais apresentaram uma maior expressão dos transcritos de RNAm das citocinas estudadas nos órgãos após o desafio com MAP, embora não tenham sido verificadas alterações macro e microscópica (coloração de Hematoxilina e Eosina). No entanto foi possível observar presença de bastonetes álcool ácido resistentes em duas amostras de placas de Peyer, (coloração de Ziehl-Neelsen) e pela técnica de nested-PCR foi possível observar a presença de MAP em todos os órgão analisados. Assim, estes resultados contribuem para a melhor compreensão da expressão de citocinas pró e anti-inflamatória nos locais da infecção em diferentes tempos pós-inoculação tanto em órgãos tidos como sitio específicos de MAP como intestino (colón e íleo) e placa de Peyer e órgãos extra-intestinais, e com isso buscar o melhor entendimento da imunopatogênese nos locais da infecção.

Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) is the etiological agent of paratuberculosis, a disease which causes chronic granulomatous enteritis preferably in domestic and wild ruminants. It is considered a disease of economic and social impact, because of losses in livestock and importance in human health, since there is evidence of possible correlation of MAP with Crohn's disease. However, much is still unknown about the developing the pathophysiology and immunopathogenesis this disease, in the sites of infection. Thus, this study has proposed verify the response of cytokines proinflammatory and anti-inflammatory by quantitative PCR and associate the expression of these cytokines with the lesions and the presence of the agent in organs of C57BL/6 mice infected intraperitoneal with strain MAP66115-98. It was applied 250μl of inoculum at 3 x 108 UFC/ml in 20 mice, and it was applied saline phosphate buffers (PBS) in eight control species. The animals were sacrificed at 30, 60, 90 and 120 days post-inoculation. In each period were collected spleen, liver, intestine (ileum and colon) and Peyer's patches of five challenged mice and two controls. It was found in the majority an upregulation in the expression profiles of proinflammatory cytokines IL-2, IFN-, and TNF-α ү, and anti-inflammatory IL-4 and IL-10 analyzed in the organs compared to controls during period of the experiment. It was observed also negative regulations in the fourth week in spleen and colon, twelfth in the spleen, ileum and Peyer's patch and the sixteenth week in the liver, colon and ileum. Statistical differences were only observed at the eighth week after the challenge for IFN-ү in liver, in spleen for expression of IL-2 and IFN-ү and in the ileum for IL-4 and TNF-α. In the fourth week, it was possible to identify increased levels of mRNA transcripts of the cytokines studied. In the liver, ileum and colon IFN-ү showed the highest level of mRNA transcripts compared to the negative control, however at higher levels spleen were observed for IL- 10. Only eight weeks it was possible to observe a statistically significant difference for the cytokine IFN-ү in the liver and spleen samples for TNF-α and IL-4 in the ileum and IL-2 in spleen. The highest levels of mRNA transcript were observed in the liver for IFN- ү, spleen for IL-2, and in the ileum Peyer's patch for IL-4 and colon for IL-10. In the twelfth week, the major mRNA transcript levels were observed in liver for IL-10 in spleen and ileum for IL-2 in colon for TNF-α and Peyer's patch for IL-4. In the sixteenth week, the major mRNA transcript levels were observed in liver and colon for IL-10 in spleen and ileum for IFN-ү and Peyer's patch for TNF-α. The animals showed increased expression of mRNA transcripts of cytokines studied organs after challenge with MAP, although not verified gross and microscopic changes (hematoxylin and eosin staining). However it was possible to observe the presence of alcohol-acid resistant rods in two samples of Peyer's patches (Ziehl-Neelsen) and nested-PCR technique was possible to observe the presence of MAP in every organ analyzed. Thus, these results contribute to a better understanding of the expression of proinflammatory and anti-inflammatory in local infection at different post-inoculation in both organs taken as site specific as MAP intestine (colon and ileum) and Peyer's patch and organs extraintestinal, and thus find a better understanding of the immunopathogenesis of infection in the local.