Efeito da nisina na contagem de Staphylococcus aureus e nas características do queijo minas artesanal da região de Araxá

Abstract

Os queijos Minas artesanais são aqueles produzidos com leite cru e atualmente são fabricados com certificação em 5 regiões tradicionais do estado de Minas Gerais sendo elas Serro, Canastra, Araxá, Cerrado e Campo das Vertentes. O queijo Minas artesanal, por ser fabricado a partir de matéria-prima que não sofreu nenhum tratamento térmico e por ser muito manipulado, pode veicular micro-organismos patogênicos no qual se destaca o Staphylococcus aureus (S. aureus), o que se torna um risco para a saúde do consumidor desse produto. O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito da adição de diferentes concentrações de nisina sobre o comportamento de S. aureus em queijo Minas artesanal da região de Araxá, durante o período de 60 dias de maturação. Também foi investigado o efeito da nisina nas características físico-químicas, na proteólise e no perfil de textura e cor dos queijos artesanais ao longo da maturação. O trabalho foi dividido em 3 etapas. Na primeira etapa, os queijos artesanais de 5 propriedades escolhidas na região de Araxá foram coletados. Além da caracterização físico-química destes queijos, realizou-se o isolamento de estirpes de S. aureus da região de Araxá e identificou-se os genes que codificam as enterotoxinas clássicas (sea-see) e o gene femA dos S. aureus isolados. Na segunda etapa, realizou-se o teste in vitro, com a finalidade de escolher qual concentração de nisina seria mais eficiente contra as estirpes de S. aureus isoladas. Na terceira etapa, as quantidades de nisina testadas foram adicionadas diretamente ao leite durante o processo de fabricação do queijo Minas artesanal. Investigou-se também o efeito de diferentes doses de nisina sobre a microbiota contaminante do queijo Minas artesanal de Araxá por meio de contagens de S. aureus, aeróbios mesófilos, coliformes totais e E. coli ao longo do período de maturação. Ainda na terceira e última etapa, identificou-se os genes que codificam as enterotoxinas clássicas (sea-see) e o gene femA dos S. aureus isolados dos queijos artesanais da região de Araxá e averiguou-se a presença de enterotoxinas estafilocócicas nestes queijos durante o período de maturação. Avaliou-se o efeito da nisina nos índices de proteólise, no perfil físico-químico, no perfil de textura e na cor instrumental dos queijos Minas artesanais de Araxá ao longo do período de maturação. Nas amostras de queijo Minas artesanal analisadas na primeira etapa do projeto, verificou-se a presença de genes que codificam para enterotoxinas em todos os isolados de S. aureus. Das 12 estirpes isoladas, 11 apresentaram genes para a enterotoxina SEA, 1 para a SEB, 5 para a SEC, 7 para a SEE e nenhuma para a SED, demonstrando o potencial enterotoxigênico destas estirpes. O resultado do teste in vitro realizado com as próprias estirpes de S. aureus isoladas, indicaram que as doses de nisina de 200, 400 e 500 UI.mL-1 foram estatisticamente iguais (P &#8805; 0,05), no entanto a dose de 400 UI.mL-1 foi a escolhida baseando-se nas interferências que podem ocorrer na matriz do queijo em relação ao efeito bactericida da nisina e também no efeito da nisina nas características dos queijos. As duas doses escolhidas para a utilização no teste in loco foram as de 100 UI.mL-1 e 400 UI.mL-1. Ambas as doses de nisina escolhidas foram igualmente efetivas na inibição de S. aureus na massa de queijo, no momento da fabricação, antes da etapa de salga, apresentando contagens menores que 10 UFC.g-1 de S. aureus. As doses de 100 e 400 UI.mL-1 também foram efetivas nos queijos durante todo o período de maturação, apresentando contagens de S. aureus menores que 10 UFC.g-1 em todos os queijos com nisina, nos tempos de 3, 7, 14, 30, 45 e 60 dias. Este resultado evidencia a atividade bactericida da nisina em relação ao desenvolvimento de S. aureus, mesmo utilizando baixas concentrações de nisina como 100 UI.mL-1. Com relação à presença de genes que codificam para enterotoxinas, 92,9% das estirpes isoladas de S. aureus na terceira etapa do teste in loco apresentaram genes para a enterotoxina SEA, 78,6% para SEE e 28,6% para SEC. Nenhumas das estirpes isoladas no teste in loco apresentaram genes que codificam para as enterotoxinas SEB e SED. Apesar da presença de genes nas estirpes isoladas, não foi encontrada a presença de enterotoxinas em nenhuma das amostras de queijos analisadas. Nas características físico-químicas, a nisina influenciou significativamente (P < 0,05) apenas o pH, a umidade e a gordura dos queijos. As diferentes concentrações de nisina não influenciaram significativamente (P &#8805; 0,05) no % NS pH 4,6/NT (extensão) e % NS TCA 12%/NT (profundidade) dos queijos. Também não houve influência significativa (P &#8805; 0,05) da nisina em relação a contagem de bactérias láticas nos queijos ao longo da maturação, o que corrobora com os índices de proteólise semelhantes para as diferentes concentrações de nisina dos queijos ao longo da maturação. Em relação aos parâmetros de textura, os queijos com 400 UI.mL-1 apresentaram maiores valores de coesividade e elasticidade em relação aos queijos com 100 UI.mL-1 e ao queijo controle. Já para firmeza, fraturabilidade, gomosidade e mastigabilidade não houve influência significativa (P &#8805; 0,05) da nisina. Na análise de cor, a nisina influenciou significativamente (P < 0,05) apenas a coordenada cromática a* que representa a escala de cor que vai do vermelho ao verde nos queijos, no entanto o efeito foi mínimo. Em relação a microbiota contaminante dos queijos, a nisina influenciou significativamente (P < 0,05) as contagens de aeróbios mesófilos, coliformes totais e E. coli. Quanto maior a dose de nisina, menor foi a contagem de aeróbios mesófilos e maior foi a contagem de coliformes totais. Nos queijos com dose de 100 UI.mL-1 e nos queijos controle as contagem de E. coli foram iguais, no entanto para os queijos com dose de 400 UI.mL-1 a contagem de E. coli foi maior.

Artisanal Minas cheeses are produced with raw milk and are manufactured in five traditional regions with certification in Minas Gerais state corresponding Serro, Canasta, Araxá, Cerrado and Campos das Vertentes. The artisanal Minas cheese traditionally made by hand and from milk without any heat treatment can bring risk to consumer being a disseminator of pathogenic microorganisms mainly Staphylococcus aureus (S. aureus), which becomes a health risk to the consumer of this product. The aim of this work was to evaluate the effect of adding different concentrations of nisin on the behavior of S. aureus in Minas Araxá cheese during the 60 days of ripening. We also investigated the effect of nisin on the physicalchemical properties of proteolysis, texture and color profile of the cheeses during ripening. The work was divided into three steps. In the first stage, the samples of artisanal cheeses from 5 chosen cheese-farms of Araxá region were collected. In addition to the physico-chemical characterization of these cheeses, we also made the isolation of S. aureus strains and the identification of the genes that encoding classical enterotoxins (sea-see) and the femA gene of S. aureus isolates. In the second step was performed the in vitro test in order to choose which concentration of nisin would be effective against strains S. aureus isolates. In the third step, the level of tested nisin were added directly to the milk during the cheese-making. We investigated the effect of different doses of nisin on the microbial contaminants of artisanal Minas Araxá cheese through the counts of S. aureus, mesophilics, total coliforms and E. coli counts during ripening. By the third and final step, we identified the genes encoding classical enterotoxins (sea-see) and femA gene of S. aureus isolates from the artisanal cheeses of Araxá region and examined for the presence of staphylococcal enterotoxins in these cheeses during the ripening period. Was also studied the effect of nisin in proteolysis, physico-chemical, texture profile and instrumental color properties of artisanal Minas Araxá cheese throughout the ripening period. In the analyzed cheese samples of artisanal Minas Araxá cheese, in the first stage of the project, there was the presence of genes encoding enterotoxins in all isolates of S. aureus. Of the 12 isolates, 11 had genes for enterotoxins SEA, 1 to the SEB, 5 to the SEC, 7 for SEE and no to the SED, demonstrating the enterotoxigenic potential of these strains. The result of the in vitro test performed with the own isolates of S. aureus isolates indicated that the levels of nisin 200, 400 and 500 UI.mL-1 showed no statistical difference (p &#8805; 0.05), but the dosage of 400 UI.mL-1 was chosen based on the interference that may occur in the matrix of the cheese relative to the bactericidal effect of nisin as well as to the effect of nisin on cheese properties. The two nisin dosages chosen for use in the in loco test were 100 and 400 UI.mL-1. Both dosages of nisin were effective in the inhibition of S. aureus in the cheese curd, before salting, presenting S. aureus counting below 10 CFU.g-1. The dosages of 100 and 400 UI.mL-1 were also effective in the cheese ripening period, showing counts for S. aureus below 10 CFU g-1 for all cheeses with nisin addition on 3, 7, 14, 30, 45 and 60 days of ripening. This result shows the bactericidal activity of nisin against S. aureus even using low concentrations of nisin as 100 UI.mL. Regarding to the presence of the genes encoding enterotoxins, 92.9% of the strains of S. aureus isolated in the third stage of the in loco test had genes for enterotoxin SEA, 78.6% for SEE and 28.6% for SEC. None of the isolates in the in loco test showed genes that encoding for enterotoxins SEB and SED. Despite the presence of genes in isolated strains, we not found the presence of enterotoxins in any of the analyzed samples. In physical-chemical properties, nisin significantly (P <0.05) influenced only the pH, moisture and fat content of the cheeses. The different concentrations of nisin not influenced significantly (P &#8805; 0.05) in the cheese ripening indexes, % NS pH 4.6 / NT and % NS TCA12% /NT. There was no significant influence (P &#8805; 0.05) of nisin against lactic acid bacteria counts in the cheeses throughout ripening, which helps to explain the similar level of proteolysis for the different concentrations of nisin addition during cheese ripening. To the texture profile parameters, the cheeses with a 400 UI.mL-1 showed highest values of cohesiveness and elasticity in relation to the cheeses with 100 UI.mL-1 and the control cheeses. On the other hand, for firmness, brittleness, gumminess and chewiness no significant influence (P &#8805; 0.05) of nisin was found. In color analysis nisin significantly influenced (P <0.05) only the color coordinate a* that represents the color scale that goes from red to green in the cheeses, but the effect was small. For microbial contaminants of the cheese, nisin significantly influenced (P <0.05) the aerobic mesophiles, total coliforms and Escherichia coli counts. As higher the nisin dosage lower aerobic mesophilic count and higher total coliforms count were found. For cheeses with dosage of 100 UI.mL-1 and the control cheeses E. coli counts were similar but for the cheeses with dosage of 400 UI.mL-1 the E. coli counts were higher.