Identificação de proteínas diferencialmente expressas em folhas de soja (Glycine max (L.) Merrill) em resposta a Phakopsora pachyrhizi.

Abstract

A ferrugem asiática da soja (FAS), cujo agente causal é o fungo Phakopsora pachyrhizi Sydow, é considerada uma das doenças mais agressivas à cultura, pois ainda não há cultivares comerciais imunes ao patógeno. O mecanismo de controle da doença mais utilizado é o uso de fungicidas, o que aumenta o custo de produção e acarreta em problemas ambientais. O controle das doenças de plantas por meio de resistência genética é a forma mais eficaz e econômica. Estudos genômicos e proteômicos têm sido feitos para o entendimento molecular da resposta do hospedeiro ao patógeno, porém, ainda há poucas informações sobre a base molecular da interação entre o agente causal da FAS e a soja, as quais são necessárias para assistir o melhoramento genético no desenvolvimento de cultivares resistentes. Neste trabalho, por meio do uso da eletroforese bidimensional associada à espectrometria de massas, foram identificadas dez proteínas diferencialmente expressas em folhas de soja em resposta à inoculação com esporos de P. pachyrhizi. Foram avaliados dois genótipos (PI561356 com resistência parcial e Embrapa 48, suscetível) em dois tempos após a inoculação (72h e 192h). Para cada tempo e genótipo foram coletadas folhas de plantas controle não inoculadas. A anidrase carbônica, 1-desoxi-D-xilulose-5-fosfato-redutoisomerase (DXR) e subunidade A da gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (GAPDHa) foram mais expressas no genótipo suscetível 192 h após inoculação (h.a.i.) quando comparado ao controle. No tempo de 72 h.a.i., foram identificadas sete proteínas diferencialmente expressas quando o genótipo resistente inoculado foi comparado ao não inoculado: proteína tumoral controlada traducionalmente, gama glutamil hidrolase, proteína ribossomal 30S de cloroplasto, fator de elongação 1-alfa, proteína de ligação à subunidade beta da Rubisco (menos expressas no inoculado), glutamina sintetase e frutose bisfosfato aldolase (mais expressas no inoculado). Algumas destas estão envolvidas com rotas metabólicas de defesa do hospedeiro ao ataque de patógenos. Estudos prévios indicam que a anidrase carbônica é uma das proteínas efetoras do ácido salicílico (AS) que exerce um importante papel nas respostas de defesa local e sistêmica. Outros trabalhos demonstram que a enzima DXR é ponto-chave na rota de síntese de fitoalexinas que são isoprenóides envolvidos na defesa contra ataque de patógenos. A frutose bisfosfato aldolase participa do metabolismo das pentoses fosfato, que é uma das vias principais para a produção de compostos fenólicos responsáveis pela ativação de mecanismos de defesa. A glutamina sintetase atua no metabolismo de nitrogênio e estudos indicam que a redução nos níveis de nitrogênio aumenta a suscetibilidade a patógenos. O aumento da expressão de GAPDHa é uma evidência do acúmulo de intermediários reativos do oxigênio como parte de um dos mecanismos de resposta da resistência adquirida sistêmica (RAS) contra o ataque de patógenos. Em concordância com outros trabalhos, a fotossíntese e a síntese global de proteínas tendem a diminuir em certos tempos de inoculação, o que observamos quando a proteína de ligação à subunidade beta da Rubisco, a proteína ribossomal 30S de cloroplasto e fator de elongação 1-alfa foram menos expressos no genótipo PI561356 72 h.a.i. Apesar do papel da proteína tumoral controlada traducionalmente, em resposta a infecção por patógenos, ser ainda desconhecido, foram observadas, em outros trabalhos, alterações na expressão desta proteína em resposta a diferentes condições fisiológicas da célula. A expressão de proteínas da seiva do xilema pode ser alterada como foi o caso da gama glutamil hidrolase menos expressa no genótipo PI561356 72 h.a.i. Resultados de outros trabalhos mostram que alterações na expressão de proteínas da seiva do xilema inibem o desenvolvimento de patógenos em plantas. Os genes que codificam as enzimas anidrase carbônica e DXR, que foram mais expressas em folhas de soja no genótipo Embrapa 48, 192 h.a.i., foram também analisados in silico. A expressão destes genes foi detectada em bibliotecas de EST (Expressed Sequence Tags) de folhas de soja inoculadas com P. pachyrhizi. Estes resultados contribuem para o aumento das informações necessárias ao entendimento do mecanismo de resposta da soja a P. pachyrhizi.

Asian soybean rust (ASR), caused by Phakopsora pachyrhizi Sydow, is considered one of the most aggressive diseases to the soybean culture, since there are no commercial cultivars immune to the pathogen. The use of fungicides is the most commonly applied control measure against the disease, but this procedure increases production cost and causes environmental problems. Plant disease control through genetic resistance is the most inexpensive and effective alternative. Genomic and proteomic studies have been carried out for molecular understanding of the host responses to pathogens, but there is little information on the molecular basis of the interaction between the ASR causal agent and soybean, which is needed for aiding genetic breeding efforts and the development of resistant cultivars. In this work, through the use of two-dimensional electrophoresis associated with mass spectrometry, ten proteins differently expressed were identified in soybean leaves in response to inoculation with spores of P. pachyrhizi. Two genotypes (PI561356 with partial resistance and Embrapa 48, susceptible) were evaluated at two time points after inoculation (72 h and 192 h). Leaves of non-inoculated control plants were collected for each time and genotype. Carbonic anhydrase, 1-deoxy-D-Xylulose-5-phosphatereductoisomerase (DXR) and subunit A of glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase (GAPDHa) were more abundantly expressed in the susceptible genotype 192 h after inoculation (h.a.i.), compared to the control. At the time point of 72 h.a.i., seven proteins differently expressed were identified when the inoculated resistant genotype was compared to the non-inoculated: translationally controlled tumor protein, gammaglutamyl hydrolase, chloroplast 30S ribosomal protein, elongation factor 1-alpha, Rubisco beta subunit binding protein (lower expression with inoculation), glutamine synthetase and fructose bisphosphate aldolase (higher expression with inoculation). Some of these proteins are involved in metabolic pathways related with host defense against pathogens. Previous studies indicate that carbonic anhydrase is a salicylic acid (SA) effector protein that plays an important role in systemic and local defense responses. Other studies demonstrate that the enzyme DXR is essential for phytoalexins biosynthesis. These compounds are isoprenoids involved in the defense against pathogen attack. The fructose bisphosphate aldolase participates in the pentose phosphate metabolism, which is one of the main pathways for production of phenolic compounds responsible for the activation of defense mechanisms. Glutamine synthetase acts on nitrogen metabolism, and studies indicate that reduced levels of nitrogen increase susceptibility to pathogens. The increased expression of GAPDHa indicates that accumulation of reactive oxygen intermediates is part of the response mechanisms of the systemic acquired resistance (SAR) against pathogen attack. Several studies show that photosynthesis and global protein synthesis tend to decrease after pathogen inoculation. This is in line with the observation that the Rubisco beta subunit binding protein, the chloroplast 30S ribosomal protein and elongation factor 1-alpha were less expressed in the genotype PI561356 72 h.a.i. Although the role of the translationally controlled tumor protein on response to infection by pathogens is still unknown, changes in the expression of this protein have been observed in other works, in response to different physiological conditions of the cell. The expression of proteins present in the xylem sap can be changed, as occurred with the gamma-glutamyl hydrolase, which was less expressed in genotype PI561356 72 h.a.i. Results from other studies show that changes in the expression of proteins present in the xylem sap inhibit the development of pathogens in plants. The genes encoding the enzymes carbonic anhydrase and DXR, which were more expressed in soybean leaves in the genotype Embrapa 48, 192 h.a.i., were analyzed in silico. Their expression was detected in EST (Expressed Sequence Tags) libraries of soybean leaves inoculated with P. pachyrhizi. The results obtained in this work will help the understanding of the mechanism of soybean response to P. pachyrhizi.