Expressão heteróloga e caracterização bioquímica e biológica da NTPDase-1 de Leishmania infantum chagasi

Abstract

A Leishmaniose Visceral (LV) é um grave problema de saúde pública em vários países do mundo incluindo o Brasil. Atualmente tem se observado um número crescente de casos no homem e no cão, sendo este último considerado principal reservatório doméstico responsável pela manutenção da doença em periferias de grandes cidades. O foco central deste trabalho é o estudo da NTPDase-1 de Leishmania infantum chagasi, agente etiológico principal da LV no Brasil. A NTPDase-1 faz parte da família das E-NTPDases, que são enzimas implicadas como fatores de virulência de alguns parasitos. Elas participam da via de salvação de purinas e da modulação da resposta imune do hospedeiro dependente de nucleotídeos extracelulares. Essas enzimas constituem importantes alvos para o desenvolvimento de novas drogas e vacinas para as leishmanioses, tanto humana quanto canina. Neste trabalho foram feitas análises de bioinformática das E-NTPDases de Leishmania braziliensis, L. infantum, L. major, Trypanosoma brucei e T. cruzi. Além disto, foi feita a clonagem, expressão em sistema bacteriano, purificação e caracterização enzimática da porção solúvel da NTPDase-1de L. infantum chagasi. A enzima purificada foi usada também para produção de anti-soro policlonal anti-NTPDase-1. Foram feitos testes de crescimento de L. braziliensis, onde foi feito tratamento com a NTPDase-1 recombinante durante o cultivo celular. Nas análises de bioinformática foi possível observar a existência de dois grupos, as NTPDases-1 e NTPDases-2. Os dados demonstram que existem conservações específicas entre enzimas do mesmo grupo, como sítios de glicosilação e predição de localização subcelular onde a maioria das isoformas-1 são preditas como secretadas e as isoformas 2 como presentes na membrana. Foram observadas algumas possíveis pontes dissulfeto conservadas em todas as sequências. Quanto as características bioquímicas, baseado em dados já existentes, viu-se clara distinção de preferência por substrato entre as enzimas dos diferentes grupos, e duas enzimas (L.i NTPDase-2 e L. m NTPDase-2), muito próximas no agrupamento, apresentam hidrólise comum para a maioria dos substratos. Quando é comparada a NTPDase-1 de T. cruzi e a de L. infantum chagasi, caracterizada neste trabalho, observa-se que o pH de atividade máxima é distinto: a enzima de T. cruzi apresenta atividade maior em pH básico (7,5- 8) e a NTPDase-1 de L. infantum chagasi em pH ácido (5,5-6,0). A L. i NTPDase-1 apresentou especificidade para GTP enquanto as outras enzimas de tripanosomatídeos hidrolisam vários nucleotídeos tri e di-fosfatados. Nas análises o efeito biológico da adição da L.i NTPDase-1 em cultura axênica de promastigotas de L. braziliensis, verificou-se uma possível influência na metaciclogênese in vitro . Todos os dados são discutidos em termos de possíveis papéis da L.i NTPDase-1 na biologia de L. infantum chagasi e na infecção do vetor e do hospedeiro, abrindo novas perspectivas de estudos na área. Os dados obtidos sugerem que esta enzima pode influenciar de no mecanismo de metaciclogênese por algum processo ainda não conhecido.

The Visceral Leishmaniasis (VL) represents an important global health problem in many countries including Brazil and it has seen a growing number of cases in humans and dogs. The dogs are being considered the main domestic reservoir responsible for maintaining the disease in the outskirts of large cities. The aim of this work is the study of Leishmania infantum chagasi NTPDase-1. L. infantum chagasi is the main etiologic agent of VL in Brazil. The NTPDase-1 is part of the E-NTPDase family, enzymes that are implicated as virulence factors of some parasites. They participate in the purines salvage pathways and in the modulation of host immune response that dependend on extra cellular nucleotides. These enzymes are important targets for the development of new drugs and effective vaccines for Leishmaniasis. In this work were made bioinformatics analysis of E-NTPDase from L. braziliensis, L. infantum, L. major, Trypanosoma brucei and T. cruzi. Moreover, was made the cloning, expression in bacterial system, purification and characterization of soluble portion of the enzyme NTPDase 1 from L. infantum chagasi. The purified enzyme was also used for production of polyclonal antiserum. In addition were evaluated the role of recombinant NTPDase-1 in the biology of f L. braziliensis. The results of the bioinformatics analysis showed the existence of two groups of Trypanosomatide NTPDases named here as NTPDase-1 and NTPDase-2. These groups presented similar predicted glycosilation pattern, transmembrane domain, disulphide bonds and substrate specifity. Comparing the T. cruzi NTPDase-1 and L. infantum chagasi NTPDase-1 (L.i. NTPDase-1),characterized in this work, we observe that the pH of maximum activity is different: the enzyme from T. cruzi has a higher activity at alkaline pH (7.5 to 8) and the NTPDase-1 from L. infantum chagasi in acidic pH (5.5 to 6.0). L.i. NTPDase-1 showed specificity for GTP while the other enzymes of Trypanosomatids hydrolyze various tri-and diphosphate nucleotides. In the analysis of biological effect of addition of L.i. NTPDase-1 in axenic culture of promastigotes of L. braziliensis, there was a possible influence on in vitro metacyclogenesis. All data are discussed in terms of possible roles of L.i. NTPDase-1 in the biology of L. infantum chagasi and the infection vector and host, opening new prospects for studies in this area. The data suggests that this enzyme may influence the mechanism of metacyclogenesis by some process not yet known.