Proteômica e peptidômica aplicadas ao estudo da defesa de plantas de tomate à injúria mecânica

Abstract

Plantas são expostas a estresses múltiplos, e suas respostas definirão sua capacidade de sobrevivência. Diferentes vias de resposta são induzidas pela ativação ou inibição de diversas proteínas, quando células de plantas são submetidas a alguma forma de estresse biótico ou abiótico. Estudos proteômicos estruturais e funcionais buscam avaliar os níveis de inibição, superexpressão e síntese diferencial dessas proteínas, focalizando o monitoramento e a análise de suas propriedades, e os seus envolvimentos nas vias de sinalização e de defesa de plantas contra estresses. A grande dificuldade desses estudos é que na maioria das vezes, a síntese diferencial de proteínas e peptídeos é induzida em pequenas quantidades, representando baixas concentrações na célula. Além disso, o proteoma celular é representado por várias proteínas constitutivas, expressas em altas quantidades para o desenvolvimento das funções celulares normais, sendo, portanto, de alta complexidade. Essa alta complexidade e alta concentração podem dificultar a visualização dessas biomoléculas induzidas por meio dos estudos proteômicos e peptidômicos. Para superar essa dificuldade de visualização é necessário o desenvolvimento de ferramentas bioquímicas que possibilitam o enriquecimento dessas amostras, permitindo, assim, a visualização e a identificação de um maior número possível de proteínas e peptídeos diferencialmente sintetizados. Para avaliar o proteoma e o peptidoma diferencial de folhas de plantas de tomate submetidas a estresse por injúria mecânica, plantas de tomateiro Santa Cruz Kada foram cultivadas por 28 dias, em casa-de- vegetação, e foram feridas por esmagamento do limbo foliar por meio de alicate (aprox. 0,5 cm de diâmetro). Folhas sem ferimento (SF) e folhas coletadas 0, 1, 2 e 7 dias após os ferimentos foram estocadas a -80oC. A extração foi realizada por maceração, na presença de N2 líquido, em tampão acrescido de inibidores de proteases e polivinilpolipirrolidona (PVPP). Os extratos foram centrifugados (20.000 g, 4oC, 25 min) e os sobrenadantes, denominados de Extrato Solúvel (ES). Os precipitados foram lavados e uma nova fração protéica foi extraída em presença de LiCl, sendo denominado Extrato de Parede Celular (EP). Os extratos solúveis foram utilizados para avaliar a atividade das enzimas indicadoras do estado de indução de resistência, lipoxigenases (LOX), peroxidases (PO), fenilalanina amônia-liase (PAL), quitinases e β-1,3-glucanases. Alteração nas atividades dessas enzimas indicou que o material-fonte de proteínas a ser usado nas análises proteômicas e peptidômicas diferenciais apresentava síntese diferencial de proteínas em resposta ao estresse envolvido. No primeiro experimento, EP foi fracionado com (NH4)2SO4 (30-75% sat.) e o precipitado recuperado foi ressuspendido em tampão de extração e avaliado quanto à síntese diferencial de proteínas utilizando cromatografia líquida multidimensional (MDLC), combinando cromatografias offline de exclusão molecular e de fase reversa. O pool GF4 (pós- exclusão molecular) apresentou o maior número de picos protéicos/peptídicos diferencialmente sintetizados. Foram identificadas massas moleculares nas frações RPGF4 correspondentes aos cinco tratamentos em diferentes tempos de eluição. Os protocolos permitiram a obtenção de 5 frações peptídicas purificadas (SF - 9.965.348 Da; 0-Dia - 5.586,304 Da; 1-Dia - 2.835,539 Da; 2-Dias - 1.611,931 Da e 7-Dias - 9.980,078 Da) e duas frações com duas massas. Análises de peptide mass fingerprint não demonstraram homologias significativas, apenas indicaram a associação desses peptídeos com mecanismos de defesas. Foi obtida uma seqüência de nove resíduos de aminoácidos (E-N-G-EI/L-V- D-I/L-N) por espectrometria de massa MS/MS de um peptídeo tríptico (2.211,399 Da) da amostra RPGF4 7-Dias (9.980,349 Da). No segundo experimento, ES e EP foram fracionados por (NH4)2SO4 (30-75% sat.). O precipitado recuperado foi resusspendido e fracionado por ultrafiltração, obtendo-se amostras protéicas em faixas de massas moleculares de 1 a 10, 10 a 30 e acima de 30 kDa, denominadas ES1-10, EP1-10, ES10-30, EP10-30, ES30 e EP30, respectivamente. Cada uma dessas frações foi submetida à análise proteômica e peptidômica, por cromatografia líquida multidimensional (MDLC) offline, utilizando-se colunas de troca aniônica e fase reversa como dimensões de separação. Os perfis cromatográficos dos tratamentos 0, 1, 2 e 7-Dias, quando comparados com o controle (SF), apresentaram picos diferenciais em todas as frações analisadas que continham diferentes faixas de massas moleculares. Após a separação por fase reversa, a fração ES30 do tratamento 7-Dias apresentou picos protéicos diferenciais quando comparados com SF. A fração ES10-30 do tratamento 2-Dias se destacou pelo maior número de picos protéicos diferenciais gerados, enquanto que para a fração ES1-10, o maior número de picos diferencialmente sintetizados foi evidenciado no tratamento 1 dia após os ferimentos. A eficiência da purificação de picos diferencialmente sintetizados associados a proteínas ligadas à indução de resistência possibilitou a análise desses picos por espectrometria de massa. Foram identificadas massas de 8.214,794, 1.612,940 e 5.724,462 Da para picos purificados a partir do extrato solúvel do tratamento 1-Dia. Já para EP1- 10 foram identificadas massas de 8.224,107; 8.214,794 e 1.567,804 Da para os tratamentos SF, 0 e 2-Dias, respectivamente. Essas amostras purificadas foram submetidas à proteólise limitada por tripsina, reduzidas e alquiladas, e as massas moleculares do perfil peptídeos foram analisadas em bancos de dados de peptide mass fingerprint, entretanto sem sucesso na obtenção de seqüências peptídicas. Os protocolos de fracionamento propostos permitiram a obtenção, com sucesso, de frações purificadas, com destaque para as vantagens obtidas pelo uso da ultrafiltração para o fracionamento prévio das amostras, sobretudo das amostras de baixa massa molecular (1 a 10 kDa), tanto para os extratos de parede celular quanto para os extratos solúveis. A intensidade dos valores de absorvância indicados nos perfis cromatográficos de fase reversa, tanto para o primeiro quanto para o segundo experimento, permitiu a observação de um grande número de picos diferenciais. Porém, em função da expressão em baixas concentrações, apenas a identificação das massas moleculares foi possível, não tendo sido obtido sucesso na obtenção de seqüências. Há necessidade de acúmulo de material protéico em alto grau de purificação para os trabalhos seguintes de identificação de seqüência e análise funcional.

Plants are exposed to multiple stresses, and their responses define their ability to survive. Different pathways of response are induced by the activation or inhibition of various proteins, when cells of plants are subjected to some form of biotic or abiotic stress. Structural and functional of proteomics studies look assess the levels of inhibition, over expression and differential synthesis of these proteins, focusing on the monitoring and analysis of their properties, and their involvement in the process of signaling and protection of plants against stress. The great difficulty of these studies is that most of the time, the synthesis of proteins and peptides differential is induced in small quantities, representing low concentrations in the cell. Moreover, the proteome is represented by several cellular protein constituent, expressed in high quantities to the development of normal cell functions and therefore of high complexity. This high complexity and high concentration may hinder the view of these biomolecules induced through proteomics and peptidomics studies. To overcome this difficulty, it is necessary to view the development of biochemical tools that enable the enrichment of these samples, thus enabling the visualization and identification of a greater number of proteins and peptides synthesized differentially. To assess the proteome and peptidome differential of leaves of tomato plants subjected to mechanical stress by injury, tomato plants (Santa Cruz Kada variety) were grown for 28 days in greenhouse, and were injured by means of pliers adapted to accomplish crush of an ground (0,5cm, to circulate) of the leaves. Leaves without injury (SF) and leaves collected 0, 1, 2 and 7 days after the wounds were kept at-80oC. The extraction was performed by maceration, in the presence of liquid N2 in buffer plus protease inhibitors, and polyvinylpolypyrrolidone (PVPP). The extracts were centrifuged (20,000 g, 4oC, 25 min) and the supernatants, denominated as Extract Soluble (ES). The precipitates were washed and a new protein fraction was extracted in the presence of LiCl, and called Extract from Wall Mobile (EP). The soluble extracts were used to assess the activity of enzymes indicator of the state of induction of resistance, lipoxygenases (LOX), peroxidases (DB), phenylalanine ammonia-lyase (PAL), chitinases and β-1, 3 - glucanases. Amendment in the activities of these enzymes indicated that the material source of protein to be used in the proteomics and peptidomics analyses of the differential synthesis of proteins in response to stress involved. In the first experiment, EP was fragmented with (NH4)2SO4 (30-75% sat.) and the precipitate was recovered in extraction buffer and evaluated for differential synthesis of proteins using multidimensional liquid chromatography (MDLC), combining of molecular exclusion and reverse phase of offline chromatography. The pool GF4 (post molecular exclusion) presented the largest number of protein and peptide peaks differentially synthesized. It have been identified in the molecular weight fractions RPGF4 corresponding to five treatments at different times of elution. The protocols allowed the taking of five fractions peptide purified (SF 9.965,348; 0-Day - 5.586,304; 1-Day - 2.835,539 Da, 2-Days - 1.611,931 and the 7-Days - 9,980 , 078 Da) and two fractions with two molecular mass. Analysis of peptide mass fingerprinting showed no significant homologies only indicated the association of these peptides with mechanisms of defenses. It obtained a sequence of nine waste of amino acids (E-N- G-E-I/L-V-D-I/L-N) by mass spectrometry MS/MS of the triptych peptide (2.211,399 Da) of the sample RPGF4 7-Days (9.980,349 Da). In the second experiment, ES and EP were fractionated by (NH4)2SO4 (30-75% sat.). The precipitate was recovered and fragmented by ultrafiltration to obtain protein samples of molecular weights between of 1 to 10, 10 and 30 and above 30 kDa, denominated to ES1-10, EP1-10, ES10-30, EP10-30, ES30 and EP30, respectively. Each of these fractions was subjected to proteomics and peptidomics analysis by multidimensional liquid chromatography (MDLC) offline, using columns of anion exchange and reversed phase as dimensions of separation. The chromatographic profiles of the treatments 0, 1, 2 and 7-Days, when compared with the control (SF), showed differential peaks in all fractions analyzed containing strips of different molecular weights. After the separation by reversed phase, the fraction ES30 treatment 7-Days presented peaks protein differential when compared to SF. The fraction ES10-30 treatment 2-Days because of the greater number of differential generated protein peaks, while for the fraction ES1-10, the highest number of peaks differentially synthesized was evidenced in treatment 1 day after the injury. The efficiency of purification of differentially peaks associated with synthesized proteins linked to the induction of resistance enabled the analysis of these peaks by mass spectrometry. They were identified mass of 8.214,794 Da, 1.612,940 Da and 5.724,462 Da for the peaks purified from the soluble extract of processing 1-Day. For EP1-10 were identified mass of 8.224,107 Da; 8.214,794 Da and 1.567,804 Da for the SF treatments, 0 and 2-Days, respectively. These purified samples were submitted to limited proteolysis by trypsin and reduced and alkyleted, the molecular weights of the peptides profile were tested in the databases of peptide mass fingerprinting, though without success in obtaining peptide sequences. The proposed protocols for fractionization allowed to obtain, with success, purified fractions, with emphasis on the benefits obtained by the use of ultrafiltration prior to the division of samples, especially samples of low molecular weight (1 to 10 kDa), to both extracts of the cell wall as to the extracts soluble. The intensity of the values of absorbance indicated in chromatographic profiles of reversed phase for both the first and for the second experiment, allowed the observation of a large number of differential peaks. However, according to the expression in low concentrations, only the identification of molecular weights was possible and was not been successful in obtaining sequences. There is need for accumulation of material on the high degree of protein purification for the work following the identification of sequence and functional analysis.