Moléculas sinalizadoras de quorum sensing em biofilmes formados por bactérias psicrotróficas isoladas de leite

Abstract

Os objetivos deste trabalho foram avaliar o efeito de diferentes meios de cultivo na formação de biofilmes e na atividade proteolítica de células sésseis e planctônicas de bactérias psicrotróficas isoladas de leite refrigerado; detectar a presença de moléculas sinalizadoras de quorum sensing produzidas por esses isolados e avaliar o efeito de furanonas e de acil homoserinas lactonas (AHLs) na formação de biofilmes. O crescimento de Pseudomonas fluorescens foi acompanhado em microplacas de poliestireno contendo diferentes meios de cultivo. A atividade proteolítica foi determinada, utilizando-se a azocaseína como substrato. As estirpes monitoras Chromobacterium violaceum CV026, Agrobacterium tumefaciens A136, WCF47 e KYC55 e Escherichia coli pSB403 foram utilizadas para estudar a produção de moléculas sinalizadoras de quorum sensing em células sésseis e planctônicas em ensaios de difusão em meios de cultura e em cromatografia em camada delgada (CCD). O efeito de furanonas e de AHLs na formação de biofilmes foi avaliado por espectrofotometria e por microscopia eletrônica de varredura. Verificou-se que meios complexos favoreceram o crescimento, mas não a formação dos biofilmes por estirpes de P. fluorescens. O cultivo em meio mínimo de sais MMS, contendo glicerol como fonte de carbono, aumentou a formação de biofilmes de P. fluorescens em microplacas e em cupons de aço inoxidável e os isolados 097, 0109, 0137 e 0141 destacaram-se por apresentar maior número de células sésseis. Isolados de Hafnia alvei 067, 071 e Aeromonas hydrophila 099 também aderiram aos cupons de aço inoxidável imersos nos meios MMS, indicando o potencial destes isolados para formar biofilme. Em MMS, a atividade proteolítica da estirpe 097 de P. fluorescens aumentou com o aumento do número de células viáveis e foi favorecida em meio triptona, extrato de levedura e fosfato - TYEP adicionado de CaCl2. A indicação da produção de moléculas sinalizadoras de quorum sensing em biofilmes de P. fluorescens 097 foi obtida pela redução da produção de violaceína pela estirpe C. violaceum e pelo estímulo da produção de ß-gal por A. tumefaciens WCF47 na presença de células sésseis e de extratos dessas células. Entretanto, a presença de moléculas sinalizadoras em extratos de células sésseis e planctônicas de P. fluorescens não foi confirmada pela técnica de CCD. A produção de AHLs foi detectada nos biofilmes de H. alvei 059, 067, 071 e A. hydrophila 099, sendo A. tumefaciens WCF47 a estirpe monitora mais sensível. Os extratos obtidos a partir de células sésseis e planctônicas de H. alvei 071 induziram resposta positiva nas monitoras E. coli pSB403 e A. tumefaciens WCF47 nos ensaios de difusão em ágar e em cromatografia em camada delgada. Verificou-se diferença significativa na inibição da formação de biofilmes de H. alvei 071 pelas furanonas, e este resultado foi confirmado por imagens obtidas por microscopia eletrônica de varredura. A adição de AHLs não afetou a formação de biofilmes nas estirpes avaliadas. A detecção de moléculas sinalizadoras produzidas pelas células sésseis das estirpes de H. alvei avaliadas e o efeito inibidor da adição de furanonas na formação dos biofilmes sugeriram a participação do sistema quorum sensing na regulação da formação dessas estruturas. Os resultados obtidos contribuem para melhor entendimento de mecanismos envolvidos na regulação da formação de biofilmes por bactérias isoladas de leite e servirão para a elaboração de estratégias de prevenção e controle de sua formação.

This study aimed to evaluate the effect of different culture media on biofilm formation and proteolytic activity of sessile and planktonic cells of psychrotrophic bacteria isolated from cooled milk; to detect the presence of quorum sensing signaling molecules produced by these isolates and to evaluate the effects of furanones and acyl homoserines lactones (AHLs) on biofilm formation. The growth of Pseudomonas fluorescens was evaluated in polystyrene microplates containg different culture media. The proteolytic activity was determined using azocasein as substrate. The monitor strains Chromobacterium violaceum CV026, Agrobacterium tumefaciens A136, WCF47 and KYC55 and Escherichia coli pSB403 were used to study the production of quorum sensing signaling molecules produced by sessile and planktonic cells in agar diffusion assays and in thin layer chromatography (TLC). The effects of furanones and AHLs in biofilm formation were evaluated by spectrophotometry and scanning electronic microscopy. It was verified that complex media favored growth, but not biofilm formation by P. fluorescens strains. The salts minimal media MMS containing glycerol as carbon source enhanced biofilm formation by P. fluorescens in microplates and in stainless steel coupons and the strains 097, 0109, 0137 had higher numbers of sessile cells. Hafnia alvei 067, 071 and Aeromonas hydrophila 099 also adhered to coupons of stainless steel immersed in MMS, indicating the potential for these isolates to form biofilms. In MMS, the proteolytic activity of P. fluorescens 097 increased with the increase in viable cell number. The proteolytic activity was favored in tryptone yeast extract and phosphate media TYEP added with CaCl2. The evidence for quorum sensing signaling molecules production in P. fluorescens 097 was obtained by reduction of violacein production by C. violaceum and β-gal production by A. tumefaciens WCF47 in the presence of sessile cells and extracts from these cells. However, the presence of signaling molecules was not confirmed by TLC. The production of AHL was detected in biofims of H. alvei 059, 067, 071 and A. hydrophila 099, being A. tumefaciens WCF47 the monitor strain most sensible to AHLs. The extracts obtained from planktonic cells supernatants of H. alvei 071 induced positive responses in the monitors E. coli pSB403 and A. tumefaciens WCF47 in agar diffusion assays and in TLC. A significant difference was verified in the inhibition of biofilm formation by H. alvei 071 in the presence of furanones and scanning electronic microscopy images confirmed this result. The addition of AHLs did not affect the biofilm formation in the strains evaluated. The detection of signaling molecules produced by sessile cells of H. alvei strains and the inhibitory effect of furanones suggest that quorum sensing influences the regulation of these structures. These results contributed to better understand the mechanisms involved in the regulation of biofilm formation by bacteria isolated from milk and it can also contribute to propose new strategies to prevent and control biofilm formation.