Purificação e caracterização parciais de serino e cisteíno proteases de Sitophilus zeamais (Coleoptera: Curculionidae) - Silva, Luciana Barboza (Universidade Federal de Viçosa, 2009)
Serino e cisteíno proteases foram purificadas de uma população susceptível e duas resistentes a inseticidas (uma com custo associado a resistência e outra sem custo) de Sitophilus zeamais. Utilizou-se coluna de afinidade aprotinina-agarose para purificar serino protease das três populações. O maior fator de purificação obtido foi para a população resistente sem custo (51,20x), com um rendimento de 14,8% e atividade específica de 875μM∕min∕mg proteína. Na SDS-PAGE uma banda de 56 kDa ficou visível nas três populações e na população resistente sem custo uma outra banda de 70 kDa também foi observada. A enzima parcialmente purificada das três populações foi inibida por PMSF, TLCK, aprotinina, benzamidina e SBTI, indicando a presença de serina e histidina no centro ativo da enzima o que a caracteriza como tripsina-like. A enzima purificada das populações resistentes tem maior afinidade pelo substrato (menor valor de KM app) e a eficiência catalítica para a população resistente sem custo foi aproximadamente duas vezes maior em relação a população susceptível. Para purificar cisteíno protease das três populações a coluna de afinidade thiol-sepharose foi utilizada. Um material homogêneo foi obtido com a purificação de cisteíno, conforme indicado na SDS-PAGE. Uma única banda, de 74 kDa foi visível na população susceptível, enquanto duas bandas de 72 e 83, e 68 e 74 kDa apareceram na população resistente com e sem custo, respectivamente. A identificação de cisteíno protease foi confirmada pelos ensaios com inibidores, realizados com as frações que apresentaram atividade proteolítica, eluídas da coluna thiol-sepharose. As cisteíno proteases, parcialmente purificadas das três populações apresentaram um comportamento diferente quanto a degradação de caseína e inibidores utilizados. A enzima parcialmente purificada da população resistente com custo foi menos sensível ao inibidor E-64, apresentando maior valor de I50 comparado as outras populações analisadas. A afinidade (i.e. KM app) da enzima pelo substrato foi similar entre as populações, porém a Vmax app foi variável, sendo que a população resistente com custo apresentou valor 5x superior, enquanto a população resistente sem custo foi 3x maior do que a Vmax app da população susceptível. Os resultados desta investigação confirmam que as populações resistentes a piretróides, são mais eficientes quanto a atividade de tripsina-like proteases, as quais tem um papel importante na mitigação do custo fisiológico associado com a manutenção dos mecanismos de resistência a inseticidas em algumas populações de S. zeamais. O papel de cisteíno proteases na mitigação do custo associado a resistência parece ser secundário em relação a serino protease.

Serine and cysteine proteases of a susceptible and two resistant strain (one with a cost associated with resistance and other without cost) of the maize weevil Sitophilus zeamais were partially purified using an affinity column of aprotinin-agarose . The highest purification factor was obtained for the resistant no-cost strain, 51.20x, with a yield of 14.8% and specific activity of 875μM∕min∕mg protein. In the SDS-PAGE a band of 56kDa was visible in the three strains, and the resistant no-cost strain also exhibited another band of 70kDa. The enzymes partially purified from the three strains were inhibited by PMSF, TLCK, aprotinin, benzamidine and SBTI, indicating the presence of serine and histidine in the enzyme active center, which is characteristic of trypsin-like serine proteases. The enzyme purified of the resistant strains have higher affinity for the substrate (lower value of KM app), and the catalytic efficiency for the resistant strain nocost was approximately 2-fold higher relative of the susceptible strain. A thiolsepharose affinity column was used to purify the cysteine protease of the three strains. Cysteine proteases partially purified from the three strains exhibited a different behavior in casein degradation and its inhibition by specied inhibitors. The enzyme partially purified from the resistant cost strain was less sensitive to the inhibitor E-64 exhibiting higher I50 compared to the other strains studied. The affinity (i.e. KM app) of the enzyme for the substrate was similar among the strains, but the Vmax app for the enzyme partially purified from the resistant cost strain was 5x greater and of resistant no-cost was 3x greater than the Vmax app of the susceptible strain. The results of this investigation confirm that the pyrethroid-resistant strains have elevated activity of trypsin-like proteases, which has an important role in mitigating the physiological cost associated with maintaining the mechanism of resistance to insecticides in some strains of S. zeamais. The role of cysteine in mitigating the cost associated with the resistance appears to be of secondary relative to that of serine proteases.
Partial purification and characterization of serine and cysteine proteases of Sitophilus zeamais (Coleoptera: Curculionidae)
Keywords: Custo fisiológico; Cinética de enzima; Gorgulho do milho; Enzimas digestivas; Resistência a inseticidas; Physiological cost; Enzymes kinetics; Maize weevil; Digestive enzymes; Resistance to insecticides; CNPQ::CIENCIAS AGRARIAS::AGRONOMIA::FITOSSANIDADE::ENTOMOLOGIA AGRICOLA