Identificação e caracterização parcial de genes diferencialmente expressos na interação tomateiro-Meloidogyne incognita - Lau, Elene Yamazaki (Universidade Federal de Viçosa, 2005)
Meloidogyne incognita é um nematóide endoparasita sedentário que induz a formação de galhas nas raízes das plantas suscetíveis. Em tomateiros com o gene Mi-1, as células próximas ao estilete dos juvenis de segundo estágio exibem reação de hipersensibilidade (HR) a partir de oito a doze horas após a inoculação. Esse trabalho objetivou identificar e caracterizar parcialmente genes envolvidos nas vias de transdução de sinais e nas respostas de defesa do tomateiro a Meloidogyne incógnita mediadas pelo gene Mi-1 utilizando a técnica de hibridização subtrativa seguida de amplificação por PCR (suppressive subtractive hybridization, SSH). A partir dos cultivares quase isogênicas de tomateiros Moneymaker (suscetível) e Motelle (resistente) inoculados com M. incognita foram construídas duas bibliotecas subtrativas enriquecidas para genes diferencialmente expressos na interação incompatível (MoI 24h e MoI 72h) e uma biblioteca para a interação compatível (MMI 24h). Foram seqüenciados 81 clones da biblioteca MoI 72h, 26 da MMI 24h e 620 da MoI 24h. As análises subseqüentes se concentraram nesta última porque as outras duas apresentaram elevada redundância ou muitos ESTs (Expressed Sequence Tags) com similaridade a genes não caracterizados. Na análise de expressão por macroarranjo, 126 (41%) entre os 307 clones não redundantes de cDNAs apresentaram expressão diferencial. A análise de Northern blot não apresentou sensibilidade suficiente para evidenciar diferenças nos níveis de expressão. Vinte e um genes foram submetidos à análise de expressão por PCR quantitativa e, entre estes, oito apresentaram indução duas horas após a inoculação. A classificação dos ESTs em categorias funcionais em potencial mostrou que 31% deles têm relação com resposta de resistência, resposta a patógenos, proteção à célula, sinalização celular ou a estresse abiótico. Os ESTs classificados como não caracterizados corresponderam a 26%. Entre os ESTs com similaridade a genes induzidos nessa interação relatados previamente, estão inibidores de proteases, quitinase, aquaporina, fenilalanina amônia liase, Ki1 e peroxidase. Entre os ESTs relacionados com defesa relatados em outros patossistemas estão os similares a genes que codificam para MAPK4, defensinas, proteínas de transferência de lipídios, PR10 e proteína 14-3-3. Os genes semelhantes a MtN19, D13F MYB ST1 e cinase dependente de cálcio parecem apresentar mais de uma cópia no genoma e os genes semelhantes a Myb1, gene relacionado à resposta de resistência, gene envolvido com a resistência sistêmica adquirida, Ki1 e a defensina parecem estar presentes em cópia única no genoma. Os transcritos dos genes correspondentes aos clones SSH08D08 (MtN19), SSH09A10 (peroxidase 10), SSH10H09 (semelhante a Ki1) e SSH09D04 (defensina) possuem cerca de 2,5 kb, 1,2 kb, 1,8 kb e 0,5 kb, respectivamente. A presença de muitos genes relacionados com defesa e a ausência de genes do patógeno na biblioteca demonstra que a subtração foi eficiente para enriquecer para genes diferencialmente expressos. A grande quantidade de genes identificados e parcialmente caracterizados fornece subsídios para o estudo funcional visando caracterizar as vias de respostas de defesa mediadas pelo gene Mi-1.

In the compatible interaction between tomato and root-knot nematode Meloidogyne incognita, galls are formed on the roots. The tomato gene Mi-1 confers resistance to M. incognita accompanied by a hypersensitive response. To elucidate the mechanisms underlying these interactions, three cDNA libraries enriched for transcripts differentially expressed in susceptible (MMI 24h) and in resistant (MoI 24h and MoI 72h) plants, respectively, were generated by suppressive subtractive hybridization (SSH). Twenty-six ESTs were generated from MMI 24h, 81 from MoI 72h and 620 from MoI 24h library. The library MoI 24 was further characterized because the first two were highly redundant or had many ESTs similar to unknown genes. The cDNA macroarray analysis of 307 nonredundant clones revealed that 126 (41%) corresponded to differentially expressed transcripts. Northern blot analysis did not show enough sensitivity to detect differential expression. Quantitative PCR was performed to investigate the expression patterns of 21 selected genes. Transcript accumulation occurred for eight out of the 21 genes two hours after M. incognita challenge in resistant plants. Classification of the ESTs into several putative functional categories showed that 31% of these ESTs represented genes involved in resistance response, pathogen and stress response, cell protection or signaling. Twenty-six percent of ESTs corresponded to genes with unknown functions. Among ESTs similar to genes known to be involved in plant- nematode interactions were trypsin-alpha amylase inhibitor, chitinase, aquaporin, phenylalanine ammonia-lyase, Ki1 and peroxidase. Among ESTs similar to genes reported in other pathosystems were MAPK4, defensins, lipid transfer proteins, PR10 and 14-3-3 proteins. The genes similar to MtN19, to D13F MYB ST1 and to calcium-dependent protein kinase 3 apparently are present in more than one copy in the tomato genome and the genes similar to Myb1, to disease resistance response protein, to systemic acquired resistance- related protein, to Ki1 and to plant defensin apparently have only one copy. The transcripts corresponding to SSH08D08 (MtN19), SSH09A10 (peroxidase 10), SSH10H09 (similar to Ki1) and SSH09D04 (plant defensin) clones have approximately 2,5 kb, 1,2 kb, 1,8 kb and 0,5 kb, respectively. The presence of various defense related genes and the absence of pathogen genes in the libraries give evidence of successfully subtraction for genes differentially expressed. The identification and partial characterization of these cDNAs will assist functional analysis aimed to elucidate the pathways activated by the Mi-1 gene.
Identification and partial characterization of genes differentially expressed in the tomato-Meloidogyne incognita interaction
Keywords: Gene de resistência; Meloidogyne incognita; Biblioteca subtrativa; cDNA; PCR quantitativa; Fisiologia de Plantas Cultivadas