Costa, Maurício DutraNascimento, Rodrigo Pires doBorges, Arnaldo ChaerFilho, José Carlos de Oliveira2024-07-092024-07-092011-04-20FILHO, José Carlos de Oliveira. Domínios funcionais em Cel9B de Thermobifida fusca e prospecção de celulases bacterianas. 2011. 80 f. Tese (Doutorado em Microbiologia Agrícola) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa. 2011.https://locus.ufv.br//handle/123456789/32390Thermobifida fusca Cel9B, também denominada de E1, é uma endoglucanase muito ativa sobre carboxi-metil celulose. É composta pelo domínio catalítico (CD) da família 9 ligado a um domínio de ligação a carboidrato da família 4 (CBM4), seguido por um domínio tipo imunoglobulina na extremidade amina e um domínio de ligação a carboidrato da família 2 (CBD2), ligado ao CD por um linker na extremidade carboxílica da proteína. Para estudar o papel do domínio catalítico e dos dois domínios de ligação a carboidratos presentes nessa enzima, foram construídas três formas variantes, clonadas e expressas em Escherichia coli. As massas moleculares de E1 e suas formas variantes foram determinadas por espectrometria de massa, e os valores obtidos foram correspondentes àqueles preditos in silico a partir da sequência de DNA. A enzima tipo selvagem e suas formas variantes foram purificadas e ensaios enzimáticos e de ligação foram realizados sobre vários substratos. O domínio catalítico mostrou as maiores atividades sobre os substratos celulósicos, porém a presença de CBD2 melhorou seu desempenho enzimático sobre celulose microcristalina e celulose amorfa tratada com ácido fosfórico, substratos nos quais detectou-se ligação de CBD2. Adicionalmente, a presença desse domínio auxiliou na degradação de xiloglucana. CBD2 apresentou ligação a α-quitina, porém E1 não possui atividade sobre esse polímero. CBM4 interferiu negativamente na degradação dos substratos celulósicos e também xiloglucana porque sua presença diminuiu a atividade enzimática nesses casos. Por outro lado, a presença de CBM4 melhorou o desempenho enzimático do CD de Cel9B sobre xilana, porém sua ligação a esse substrato não foi detectada. O alinhamento de membros da família de CBM4 de Cellulomonas fimi, Thermotoga maritima e T. fusca mostrou que resíduos de aminoácidos aromáticos envolvidos na ligação ao substrato estão presentes em posições conservadas em E1 e o modelo gerado para sua estrutura mostrou região potencial para ligação de substrato. Neste trabalho foi obtido também um banco de bactérias celulolíticas provenientes do solo da mata do Belvedere, crescimento secundário de mata Atlântica, e do solo de mata de eucalipto, plantada na mesma região. O meio ágar arginina glicerol foi o mais eficaz para o isolamento de bactérias celulolíticas a partir do solo de mata do Belvedere ou mata de eucalipto, porém o meio ágar extrato de solo demonstrou um maior potencial para isolamento de microrganismos diversos, uma vez que proporcionou o crescimento exacerbado de fungos, não presentes nas mesmas condições nos outros meios. Os isolados mostraram diversidade de características macro e microscópicas, sendo em sua maioria organismos Gram positivos, e das 317 bactérias isoladas, 57 foram detectadas como produtoras de celulases pelo teste de celulose azure. O isolado 103 possui o conjunto de celulases mais ativas contra esse substrato, nas condições testadas. Este isolado é o candidato para continuação dos estudos nesta linha de pesquisa no laboratório de Microbiologia Industrial da Universidade Federal de Viçosa. A diversidade de enzimas celulolíticas obtidas pode propiciar o uso de seus determinantes genéticos em evolução direcionada às características requeridas para processos industriais de bioconversão de resíduos celulósicos.Thermobifida fusca Cel9B, also known as E1, is a very active endoglucanase against carboximethyl cellulose. The enzyme is comprised of several domains as follows: a catalytic domain (CD) which belongs to the family 9, a family 4 carbohydrate binding domain (CBD) followed by an Ig-like domain linked to CD in the N-terminus, and finally in the C-terminus, a family 2 CBD linked to the CD via a linker. To study the carbohydrate binding domains, 3 mutant genes of Cel9B were constructed, cloned, and expressed in Escherichia coli. The molecular weights of the native and the variant forms of E1 were determined by mass spectrometry, and the values are in good agreement with those predicted from the DNA sequence. The activity and binding capabilities of purified native and mutant enzymes were assayed against several substrates. The catalytic domain showed the greatest activities against cellulosic substrates, however CBD2 improved its performance against microcrystalline cellulose and phosphoric acid swollen cellulose, substrates that showed binding to CBD2. Additionally, the forms containing CBD2 showed better enzymatic performance against xyloglucan. CBD2 was able to bind to α-chitin, even though E1 did not show any activity against this polymer. CBM4 interfered negatively on the degradation of cellulosic substrates and also of xylocan, as the enzyme constructs that contained this domain decreased the enzymatic activities. On the other hand, CBM4 improved CD enzymatic performance of E1 against xylan albeit the binding to this substrate was not detected. The alignment of CBM4 sequences from Cellulomonas fimi, Thermotoga maritma and T. fusca showed that aromatic amino acid residues involved in ligand binding are present in conserved positions in this domain in E1 and the model generated for its structure showed a putative region for ligand binding. Also in this work, we obtained a cellulolytic bacterial collection from Belvedere forest soil, a secondary growth of Atlantic forest, and from eucalyptus forest soil, planted in the same region. The medium arginine glycerol agar was the best to isolate cellulolytical bacteria either from Belvedere forest or from eucalyptus forest, but the soil extract agar demonstrated the best potential to isolate diverse microorganisms as it was observed exacerbated fungi growth, not seen in the same conditions in the other media. The isolated bacteria showed diversity of macro and microscopic characteristics, with the majority being Gram positive microorganisms. From the 317 isolated bacteria, 57 were detected as cellulase producers by the cellulose azure test, with isolate 103 having the most active cellulases against this substrate, under the tested conditions. This isolate is a strong candidate for further studies in this research line in the Industrial Microbiology laboratory at Federal University of Viçosa. The diversity of cellulolytic enzymes seen in this work may be used in directed evolutionary studies towards developing desired characteristics in industrial processes for the bioconversion of cellulosic residues.porAcesso AbertoCelulasesActinomicetosModulos de Ligação à CeluloseThermobifida fuscaTeseMicrobiologia Aplicada