Bioquímica Aplicada
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Item Desvendando o secretoma do fungo fitopatogênico Chrysoporthe cubensis LPF-1 cultivado em biomassa lignocelulósica como potencial fonte de enzimas para produção de bioetanol(Universidade Federal de Viçosa, 2019-07-08) Tavares, Murillo Peterlini; Guimarães, Valéria Monteze; http://lattes.cnpq.br/0505206837779243A crescente preocupação com a escassez de combustíveis fósseis e o aumento da emissão de gases do efeito estufa, tem resultado no aumento do interesse em nível global por fontes de energia alternativas que sejam sustentáveis. Esforços têm sido feitos para atingir esses objetivos, como o desenvolvimento de tecnologias que utilizam a biomassa de resíduos agroindustriais para a produção de biocombustíveis. Nesse contexto, o Brasil se destaca como o maior produtor de cana-de-açúcar do mundo. A utilização da biomassa lignocelulósica proveniente do bagaço de cana-de-açúcar para a produção de etanol de segunda geração torna-se uma alternativa promissora para a redução dos impactos ambientais provenientes do uso de combustíveis fósseis. Considerando o processo de conversão bioquímica de biomassa em etanol, a hidrólise enzimática é normalmente referida como a etapa limitante, devido ao custo elevado de enzimas comerciais. Dessa forma, o desenvolvimento de bioprocessos para produção das enzimas on-site e estratégias para aumentar o rendimento final da hidrólise enzimática são necessários para assegurar que a conversão de biomassa se torne financeiramente viável em etapas de produção em larga escala. Uma vez que o extrato enzimático do fungo fitopatogênico Chrysoporthe cubensis LPF-1 apresentou elevada eficiência para sacarificação da biomassa lignocelulósica em diferentes abordagens, tornou-se essencial conhecer detalhadamente as enzimas e proteínas secretadas por este fungo, especialmente aquelas envolvidas na hidrólise de biomassa. Para tanto, o objetivo deste trabalho foi caracterizar pela primeira vez os perfis proteicos produzidos e secretados por C. cubensis crescido em estado semi-sólido tendo o farelo de trigo ou bagaço de cana-de açúcar como fontes de carbono, e realizar a integração de predições in silico obtidas por ferramentas computacionais com os dados de proteômica obtidos por espectrometria de massas. A integração dos resultados computacionais com os dados proteômicos possibilitou o aumento da identificação das proteínas secretadas e a previsão de todo o potencial de secreção do fungo que pode ser induzido por outras fontes de carbono ou condições de cultivo, evidenciando seu real potencial como microrganismo produtor de lignocelulases. O presente trabalho demonstrou que C. cubensis foi capaz de secretar um maior número e variedade de enzimas ativas em carboidratos do que microrganismos reconhecidamente consideradas excelentes fontes de enzimas industriais, como os fungos do gênero Aspergillus e Penicillium. Também foi observado que C. cubensis apresentou composição do secretoma com características exclusivas de acordo com a fonte de carbono ao qual foi cultivado, revelando uma grande plasticidade no perfil de secreção enzimática do fungo. C. cubensis é capaz de produzir diferentes coquetéis enzimáticos eficientes que podem ser aplicados em uma variedade de biomassas lignocelulósica com características distintas, o que normalmente não é encontrado em produtos comerciais que possuem composição definida e aplicação restrita às biomassas comumente utilizadas. Além disso, C. cubensis foi capaz de secretar famílias de enzimas que têm sido extensivamente estudadas como alvos de grande interesse biotecnológico, como as oxidases de multi- cobre (MCOs). C. cubensis foi capaz de secretar duas MCOs quando cultivado em uma mistura de farelo de trigo e casca de laranja na proporção 3:1. A fração purificada contendo as duas MCOs catalisou a oxidação dos compostos fenólicos produzidos pelo pré-tratamento alcalino do bagaço de cana-de-açúcar, o que resultou em melhores rendimentos de sacarificação deste material, demonstrando serem enzimas promissoras para aplicações em hidrólise de biomassa e de grande potencial biotecnológico. Dessa forma, C. cubensis emerge como alternativa promissora para a produção de enzimas lignocelulolíticas clássicas e como fonte de novos alvos enzimáticos para a indústria de bioetanol.Item Transcriptoma, proteoma e cinética das proteases intestinais de lagarta da soja: características da resposta bioquímica a inibidores de proteases de natureza proteica(Universidade Federal de Viçosa, 2022-06-20) Silva Júnior, Neilier Rodrigues da; Oliveira, Maria Goreti de Almeida; http://lattes.cnpq.br/6118347723704489Os inibidores de protease (IP) produzidos pelos vegetais têm um amplo espectro de proteases- alvo. No entanto, as pragas agrícolas encontraram formas de debelar os efeitos negativos dos IP de suas plantas hospedeiras. Para compreender os mecanismos moleculares e fisiológicos envolvidos na interação inseto-planta, a lagarta da soja (Anticarsia gemmatalis) e a soja (Glycine max) foram utilizadas como animal e planta modelo. Por meio de diferentes abordagens bioquímicas e biológicas, este trabalho apresentou as hidrolases intestinais da A. gemmatalis com elevada cobertura mediante à metodologia de 1DE-LC/MS proposta. Essa estratégia, apresentada de forma inédita, possibilitou a identificação de 98 hidrolases não redundantes, compreendendo isoformas importantes no mecanismo adaptativo do inseto a IP de plantas. As variações ocorridas nesse proteoma foram avaliadas expondo a lagarta a IP. Os resultados mostraram modulações fisiológicas que foram capazes de driblar os efeitos negativos dos inibidores. Houve aumento de isoformas responsáveis por atividades proteolíticas bem como aumento de proteínas relacionadas a processos de estresse. A presença de IP na dieta causou respostas nas atividades enzimáticas que revelaram uma melhor adaptação da lagarta ao IP natural da soja quando comparado a inibidores sintéticos. As análises de docking molecular mostraram a termodinâmica e os sítios de ligação envolvidos no complexo enzima-inibidor (EI), revelando características importantes para um IP eficiente. Usando esse conhecimento como base, um tripeptídeo (GORE2) foi racionalmente desenhado para atuar como inibidor de tripsinas-like de A. gemmatalis. O transcriptoma do intestino da lagarta mostrou que a presença do GORE2 e do SKTI, inibidor natural da soja, foram responsáveis por 1474 genes diferencialmente expressos, revelando importantes enzimas envolvidas na resposta do inseto. O GORE2 proposto mostrou-se mais eficiente que o SKTI ao provocar danos celulares no epitélio intestinal. Os danos mais intensos e extensos provocados pelo inibidor peptídico foram acompanhados por estresse oxidativo e pela baixa eficiência na resposta do inseto para se desintoxicar do estresse oxidativo por meio de enzimas antioxidantes. Esses resultados permitiram um melhor entendimento sobre o arsenal bioquímico e molecular do herbívoro para propor um IP potente, abrindo caminho para novas abordagens no desenvolvimento de defensivos agrícolas ambientalmente corretos e eficientes no manejo de pragas. Palavras-chave: Anticarsia gemmatalis. Enzimologia. Glycine max. Manejo de pragas agrícolas. Proteômica.Item Análises bioquímica, microbiológica e proteômica de pacientes com sepse(Universidade Federal de Viçosa, 2021-05-27) Leal, Dalila Teixeira; Oliveira, Maria Goreti de Almeida; http://lattes.cnpq.br/9063675498055119A Sepse é caracterizada, de acordo com o The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock, como a disfunção orgânica com risco de vida, causada por resposta desregulada à infecção. Na presente investigação, realizou-se estudo retrospectivo observacional com objetivo de analisar os parâmetros bioquímicos, microbiológicos e proteômicos de pacientes com Sepse internados em uma Unidade de Terapia Intensiva (UTI) de hospital da Zona da Mata de Minas Gerais, Brasil. Essa tese apresenta a seguinte estrutura: Introdução, apresentando revisão dos principais conceitos relativos à Sepse; três Capítulos correspondentes a três artigos; Discussão e Conclusão Geral; mais as Referências. O primeiro Capítulo descreveu os principais microrganismos encontrados nas amostras clínicas dos pacientes internados com Sepse e a resistência antimicrobiana apresentada por esses patógenos. Demonstrou-se que os dispositivos invasivos mais utilizados pelos pacientes com Sepse (n=19) foram o cateter venoso central, o ventilador mecânico e o cateter urinário. As axilas e a secreção traqueal foram os locais mais colonizados. Os microrganismos isolados, relacionados com a colonização, foram a Psudomonas aeruginosa, Enterobacter spp. e Acinetobacter spp. Em relação a infecção, o trato urinário foi o mais acometido e o principal microrganismo relacionado a esta infecção foi a Pseudomonas aeruginosa. Nas culturas investigadas, relacionadas tanto com a colonização, quanto infecção, Ciprofloxacino foi o antimicrobiano ao qual as bactérias apresentaram maior resistência. O segundo Capítulo teve por escopo a análise dos parâmetros bioquímicos e as relações entre neutrófilo/linfócitos (RNL), plaquetas/linfócitos (RPL) e linfócitos/monócitos (RLM) de pacientes com Sepse, internados na UTI (n=7). As principais fontes de infecção foram o sistema respiratório e o abdômen. O microrganismo mais frequente, isolado nas culturas, foi a Escherichia coli. Os valores de creatinina, ureia e FiO 2 apresentaram-se elevados desde o início da internação para os enfermos com Sepse que evoluíram para o óbito. Nos pacientes que faleceram, a Relação Neutrófilo/Linfócito (RNL) aumentou ao longo do tempo, ao contrário dos doentes que sobreviveram, os quais apresentaram queda nesses valores ao longo do tempo. A RNL mostra-se como marcador prognóstico importante para Sepse. O terceiro capítulo orientou-se à descrição dos spots de proteínas, encontrados ao longo do tempo (T1xT2 e T2xT3), obtidos por análise de detecção e quantificação diferencial sobre os géis 2DE, com diferenças estatísticas nas comparações entre enfermos com Sepse (n=7) que receberam alta e aqueles que evoluíram para a óbito. A análise longitudinal mostrou que houve diferenças entre os dois grupos quanto ao tempo e desfecho da doença. Os pacientes que evoluíram para o óbito tiveram número maior de spots proteínas alteradas ao longo do tempo, principalmente entre os tempos T2 e T3. Novos estudos são necessários à caracterização microbiológica e bioquímica dos pacientes com Sepse, especialmente no que concerne a correlação entre esses dados, que provavelmente contribuirá à melhor compreensão desta importante condição mórbida. Palavras-chave: Prognóstico. Proteômica. Sepse. Spots de Proteína.Item Caracterização molecular da interação das cigarrinhas-das-pastagens (Mahanarva spectabilis) com diferentes forrageiras(Universidade Federal de Viçosa, 2019-07-30) Monteiro, Luana Pereira; Oliveira, Maria Goreti de Almeida; http://lattes.cnpq.br/0459373882356070A cigarrinha-das-pastagens, Mahanarva spectabilis (Distant,1909) é a principal praga em forrageiras na América Tropical, promovendo danos severos às pastagens, e comprometendo a produção de produtos de origem animal. O Brasil possui o maior rebanho comercial do mundo, e para garantir baixos custos na produção, usa as pastagens como a principal fonte de alimentação do rebanho. Em decorrência de ataques de insetos- praga, o nível de produtividade das pastagens pode sofrer declínio tanto na quantidade quanto na qualidade de produção. A seleção de cultivares de forrageiras resistentes, é uma alternativa de controle promissora, uma vez que o controle químico das cigarrinhas é economicamente inviável. São escassos os trabalhos que relatam a bioquímica da interação entre M. spectabilis com diferentes forrageiras. O objetivo, na primeira parte do trabalho, foi identificar as proteínas, metabólitos e hormônios presentes nas glândulas salivares quando a M. spectabilis se alimenta de plantas de capim- elefante (Cenchrus purpureus), cv. Roxo Botucatu e cv. Pioneiro, Brachiaria brizantha cv. Marandú e Brachiaria decumbens cv. Basilisk. Na segunda parte, objetivamos elucidar as possíveis respostas metabólicas nas forrageiras Brachiaria brizantha, Brachiaria decumbens, capim-elefante (Cenchrus purpureaus) cv. Roxo-de-Botucatu e cv. Pioneiro quando infestadas por M. spectabilis. Através das análises de proteômica foi possível identificar proteínas envolvidas em processos como controle da musculatura, síntese e metabolismo protéico, proteção contra estresse biótico/abiótico e termoregulação. As análises fitohormonais das glândulas salivares indicam uma variação nos níveis hormonais em função do tipo de forrageira usada na alimentação. Foram detectados nos componentes das glândulas salivares a presença de efetores, tais como ácidos graxos de cadeia longa que podem induzir ou suprimir as respostas de defesa das plantas. A presença dos efetores afetam as respostas de defesa da planta para permitir o melhor desempenho do inseto na infestação das plantas. De frente a esses resultados, nos é permitido propor que alguns efetores presentes nas glândulas salivares de cigarrinha das pastagens possam ser responsáveis por suprimir a resposta de defesa da planta, tornando-se uma estratégia bem sucedida do inseto na colonização do hospedeiro. Palavras-chave: Cigarrinha-das-pastagens. Glândula salivar. Proteômica. Interação planta-praga.Item Interação cigarrinha-das-pastagens (Mahanarva spectabilis) e capim-elefante: análise proteômica dos ovos e efetores em glândulas salivares(Universidade Federal de Viçosa, 2018-02-28) Saraiva, Nayara Braga; Oliveira, Maria Goreti de Almeida; http://lattes.cnpq.br/8955261864482150A cigarrinha-das-pastagens, Mahanarva spectabilis (Distant,1909) é a principal praga em forrageiras na América Tropical. Este inseto entra em diapausa na fase de ovo durante as estações desfavoráveis do ano. Informações sobre os processos de desenvolvimento da diapausa das cigarrinhas das pastagens e a reprogramação de defesas das plantas durante a colonização do inseto são necessárias para auxiliar no desenvolvimento de táticas de seu controle. Por meio de análises proteômicas nós identificamos e caracterizamos proteínas envolvidas em ovo de M. spectabilis durante a diapausa, não-diapausa e pós-diapausa. Essas estão envolvidas no processamento de informações, sinalização celular e metabolismo dos ovos deste inseto. Na segunda etapa deste trabalho foi detectado a presença de efetores nas glândulas salivares de Mahanarva spectabilis, tais como ácidos graxos de cadeia longa e ácido salicílico que podem estar envolvidos no processo de infestação de plantas de capim- elefante. Também foi confirmado e caracterizado a presença de apirases nas glândulas salivares das M. spectabilis, evidenciando que esta enzima interfere na modulação de resistência da planta. As análises fitohormonais das folhas de capim elefante indicam uma flutuação nos níveis de hormônios em função do tempo de infestação. Estes resultados nos permitem propor que efetores presentes nas glândulas salivares de cigarrinha das pastagens são responsáveis por suprimir a resposta de defesa da planta, tornando-se uma estratégia bem sucedida do inseto na colonização do hospedeiro.