Bioquímica Aplicada
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Item Desvendando o secretoma do fungo fitopatogênico Chrysoporthe cubensis LPF-1 cultivado em biomassa lignocelulósica como potencial fonte de enzimas para produção de bioetanol(Universidade Federal de Viçosa, 2019-07-08) Tavares, Murillo Peterlini; Guimarães, Valéria Monteze; http://lattes.cnpq.br/0505206837779243A crescente preocupação com a escassez de combustíveis fósseis e o aumento da emissão de gases do efeito estufa, tem resultado no aumento do interesse em nível global por fontes de energia alternativas que sejam sustentáveis. Esforços têm sido feitos para atingir esses objetivos, como o desenvolvimento de tecnologias que utilizam a biomassa de resíduos agroindustriais para a produção de biocombustíveis. Nesse contexto, o Brasil se destaca como o maior produtor de cana-de-açúcar do mundo. A utilização da biomassa lignocelulósica proveniente do bagaço de cana-de-açúcar para a produção de etanol de segunda geração torna-se uma alternativa promissora para a redução dos impactos ambientais provenientes do uso de combustíveis fósseis. Considerando o processo de conversão bioquímica de biomassa em etanol, a hidrólise enzimática é normalmente referida como a etapa limitante, devido ao custo elevado de enzimas comerciais. Dessa forma, o desenvolvimento de bioprocessos para produção das enzimas on-site e estratégias para aumentar o rendimento final da hidrólise enzimática são necessários para assegurar que a conversão de biomassa se torne financeiramente viável em etapas de produção em larga escala. Uma vez que o extrato enzimático do fungo fitopatogênico Chrysoporthe cubensis LPF-1 apresentou elevada eficiência para sacarificação da biomassa lignocelulósica em diferentes abordagens, tornou-se essencial conhecer detalhadamente as enzimas e proteínas secretadas por este fungo, especialmente aquelas envolvidas na hidrólise de biomassa. Para tanto, o objetivo deste trabalho foi caracterizar pela primeira vez os perfis proteicos produzidos e secretados por C. cubensis crescido em estado semi-sólido tendo o farelo de trigo ou bagaço de cana-de açúcar como fontes de carbono, e realizar a integração de predições in silico obtidas por ferramentas computacionais com os dados de proteômica obtidos por espectrometria de massas. A integração dos resultados computacionais com os dados proteômicos possibilitou o aumento da identificação das proteínas secretadas e a previsão de todo o potencial de secreção do fungo que pode ser induzido por outras fontes de carbono ou condições de cultivo, evidenciando seu real potencial como microrganismo produtor de lignocelulases. O presente trabalho demonstrou que C. cubensis foi capaz de secretar um maior número e variedade de enzimas ativas em carboidratos do que microrganismos reconhecidamente consideradas excelentes fontes de enzimas industriais, como os fungos do gênero Aspergillus e Penicillium. Também foi observado que C. cubensis apresentou composição do secretoma com características exclusivas de acordo com a fonte de carbono ao qual foi cultivado, revelando uma grande plasticidade no perfil de secreção enzimática do fungo. C. cubensis é capaz de produzir diferentes coquetéis enzimáticos eficientes que podem ser aplicados em uma variedade de biomassas lignocelulósica com características distintas, o que normalmente não é encontrado em produtos comerciais que possuem composição definida e aplicação restrita às biomassas comumente utilizadas. Além disso, C. cubensis foi capaz de secretar famílias de enzimas que têm sido extensivamente estudadas como alvos de grande interesse biotecnológico, como as oxidases de multi- cobre (MCOs). C. cubensis foi capaz de secretar duas MCOs quando cultivado em uma mistura de farelo de trigo e casca de laranja na proporção 3:1. A fração purificada contendo as duas MCOs catalisou a oxidação dos compostos fenólicos produzidos pelo pré-tratamento alcalino do bagaço de cana-de-açúcar, o que resultou em melhores rendimentos de sacarificação deste material, demonstrando serem enzimas promissoras para aplicações em hidrólise de biomassa e de grande potencial biotecnológico. Dessa forma, C. cubensis emerge como alternativa promissora para a produção de enzimas lignocelulolíticas clássicas e como fonte de novos alvos enzimáticos para a indústria de bioetanol.Item Transcriptoma, proteoma e cinética das proteases intestinais de lagarta da soja: características da resposta bioquímica a inibidores de proteases de natureza proteica(Universidade Federal de Viçosa, 2022-06-20) Silva Júnior, Neilier Rodrigues da; Oliveira, Maria Goreti de Almeida; http://lattes.cnpq.br/6118347723704489Os inibidores de protease (IP) produzidos pelos vegetais têm um amplo espectro de proteases- alvo. No entanto, as pragas agrícolas encontraram formas de debelar os efeitos negativos dos IP de suas plantas hospedeiras. Para compreender os mecanismos moleculares e fisiológicos envolvidos na interação inseto-planta, a lagarta da soja (Anticarsia gemmatalis) e a soja (Glycine max) foram utilizadas como animal e planta modelo. Por meio de diferentes abordagens bioquímicas e biológicas, este trabalho apresentou as hidrolases intestinais da A. gemmatalis com elevada cobertura mediante à metodologia de 1DE-LC/MS proposta. Essa estratégia, apresentada de forma inédita, possibilitou a identificação de 98 hidrolases não redundantes, compreendendo isoformas importantes no mecanismo adaptativo do inseto a IP de plantas. As variações ocorridas nesse proteoma foram avaliadas expondo a lagarta a IP. Os resultados mostraram modulações fisiológicas que foram capazes de driblar os efeitos negativos dos inibidores. Houve aumento de isoformas responsáveis por atividades proteolíticas bem como aumento de proteínas relacionadas a processos de estresse. A presença de IP na dieta causou respostas nas atividades enzimáticas que revelaram uma melhor adaptação da lagarta ao IP natural da soja quando comparado a inibidores sintéticos. As análises de docking molecular mostraram a termodinâmica e os sítios de ligação envolvidos no complexo enzima-inibidor (EI), revelando características importantes para um IP eficiente. Usando esse conhecimento como base, um tripeptídeo (GORE2) foi racionalmente desenhado para atuar como inibidor de tripsinas-like de A. gemmatalis. O transcriptoma do intestino da lagarta mostrou que a presença do GORE2 e do SKTI, inibidor natural da soja, foram responsáveis por 1474 genes diferencialmente expressos, revelando importantes enzimas envolvidas na resposta do inseto. O GORE2 proposto mostrou-se mais eficiente que o SKTI ao provocar danos celulares no epitélio intestinal. Os danos mais intensos e extensos provocados pelo inibidor peptídico foram acompanhados por estresse oxidativo e pela baixa eficiência na resposta do inseto para se desintoxicar do estresse oxidativo por meio de enzimas antioxidantes. Esses resultados permitiram um melhor entendimento sobre o arsenal bioquímico e molecular do herbívoro para propor um IP potente, abrindo caminho para novas abordagens no desenvolvimento de defensivos agrícolas ambientalmente corretos e eficientes no manejo de pragas. Palavras-chave: Anticarsia gemmatalis. Enzimologia. Glycine max. Manejo de pragas agrícolas. Proteômica.Item Avaliação do potencial de aplicação industrial de subprodutos da cadeia produtiva das palmeiras amazônicas Açaí (Euterpe oleracea), Tucumã do Amazonas (Astrocaryum aculeatum) e Tucumã do Pará (Astrocaryum vulgare)(Universidade Federal de Viçosa, 2021-08-30) Santos, Kimberly Luciana Beira-Mar dos; Guimarães, Valéria Monteze; http://lattes.cnpq.br/1191165975709933O crescente aumento demográfico associado à demanda por insumos e energia é uma preocupação mundial. Várias estratégias estão sendo desenvolvidas visando mitigar os efeitos do consumo de recursos não-renováveis, uma delas é o uso de biomassas vegetais, que surgem como uma alternativa limpa, sustentável e abundante. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial de aplicação industrial de subprodutos das cadeias produtivas de biomassas amazônicas como o açaí, tucumã do Amazonas e tucumã do Pará. Ensaios de caracterização química destas biomassas amazônicas permitiram compreender a composição e a grande biodisponibilidade de moléculas de interesse biotecnológico, como polissacarídeos, lignina, proteínas e lipídios. Baseado na composição rica em nutrientes, a casca de tucumã do Amazonas in natura e a fibra da polpa de tucumã do Pará, foram avaliadas quanto ao seu potencial como fonte de carbono na indução de enzimas lignocelulolíticas utilizando cinco fungos conhecidos pela sua produção de (hemi)celulases, são eles: Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum, Chrysoporthe cubensis, Trichoderma deliquescens e Ceratocystis fimbriata. Os resultados mostraram que ambas as biomassas são excelentes fontes de carbono, no entanto os extratos enzimáticos mais completos em termos de atividade enzimática e quantidade de enzimas foi produzido pelos fungos C. cubensis e T. deliquescens cultivados na casca de tucumã do Amazonas. Além disso, ensaios de hidrólise enzimática das biomassas foram realizados utilizando os extratos enzimáticos brutos de C. cubensis e T. deliquescens e o coquetel comercial CellicCTec 2. Os melhores resultados de liberação de glicose foram alcançados na hidrólise da fibra polpa de tucumã do Pará processada pelos coquetéis de C. cubensis e T. deliquescens. As análises experimentais permitiram concluir que a biodisponibilidade das biomassas aqui estudadas pode ser a chave para o desenvolvimento regional sustentável, pois permite que os recursos naturais sejam completamente aproveitados de forma racional e consciente, mas também gerando retorno econômico e desenvolvimento social. Palavras-chave: Açaí. Tucumã do Amazonas. Tucumã do Pará. Caracterização química. Hidrólise enzimáticaItem Enzimas vegetais e fúngicas com potencial nematicida(Universidade Federal de Viçosa, 2018-03-02) Sufiate, Bruna Leite; Queiroz, José Humberto de; http://lattes.cnpq.br/2650132859878837Fungos e plantas produzem enzimas que possuem as mais diversas aplicações biotecnológicas. Uma possível e promissora aplicação dessas enzimas é o controle de nematoides, em substituição aos nematicidas químicos prejudiciais à saúde humana e animal, ao meio ambiente e à microbiota do solo. Outra possível aplicação das enzimas de fungos é o uso da dextranase na redução de dextrana na indústria sucroalcooleira. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo investigar a produção de enzimas pelo fungo Pleurotus eryngii e pelas plantas Euphorbia milii e E. trigona, purificar e caracterizar as enzimas de E. milii, E. trigona e Pochonia chlamydosporia, e testar a atividade nematicida das enzimas das plantas E. milii, E. trigona e do fungo P. eryngii. O fungo P. eryngii e seu extrato reduziram significativamente (p<0,01) o número de larvas intactas de Panagrellus sp. após 24 horas de tratamento em 60 e 90%, respectivamente. Este efeito não está relacionado à atividade enzimática, mas sim à presença de outros metabólitos. Os ovos de Meloidogyne javanica, quando tratados com o extrato de P. eryngii, mostraram redução de 53% (p<0,01) no número de ovos intactos. A redução de ovos intactos de M. javanica é atribuída à atividade enzimática, uma vez que o extrato apresentou atividade quitinolítica e proteolítica de, respectivamente, 32,74 e 3,57 U/mL. A purificação do látex de E. trigona por cromatografia de exclusão molecular permitiu a purificação de três proteases distintas. O peso molecular das proteases foi estimado em aproximadamente: 36, 31 e 29 kDa, para a trigonina 1, 2 e 3, respectivamente. O pH e a temperatura que proporcionaram maior atividade de protease foram 4,0, 6,0 e 9,0, e temperatura de 70 °C. As proteases foram inibidas por fluoreto de fenilmetilsulfonila e iodoacetamida. O pool das três proteases presentes no látex de E. trigona reduziram significativamente (p<0,01) o número de J 2 vivas de M. incognita em 96% após 24 horas de tratamento. A purificação parcial das proteases presentes no látex de E. milii indicou que estas proteases correspondem à milina e miliina. Estas enzimas reduziram em 65,59% e 96,46% o número de larvas de Panagrellus redivivus após 24 e 48 h, respectivamente (p<0,01). A dextranase produzida pelo fungo P. chlamydosporia foi purificada à homogeneidade em duas etapas, com rendimento de 152%, fator de purificação de 6,84 e atividade específica de 358,63 U/mg. Seu peso molecular foi estimado por SDS-PAGE em 64 kDa. A enzima apresentou maior atividade a 50 °C e pH 5,0, usando tampão citrato-fosfato 100 mM, foi inibida por Ag 1+ , Hg 2+ , Cu 2+ , Mg 2+ , e apresentou K M de 1,77 g/L. A dextranase madura é composta por 585 resíduos de aminoácidos, com peso molecular predito de 64,38 kDa e pI 5,96. Esta dextranase demonstrou forte semelhança filogenética em comparação à dextranase de Trichoderma harzianum. Sua estrutura consiste de dois domínios: o primeiro composto por 15 cadeias beta, e o segundo composto por uma β-hélice paralela. Esses resultados evidenciam o potencial biotecnológico desses fungos, plantas e suas enzimas extracelulares informações acerca no da controle dextranase de nematoides, produzida pelo e fornecem fungo P. chlamydosporia, que podem ser utilizadas para futuras aplicações industriais desta enzima.