Bioquímica Aplicada
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Item Unveiling plant cell signaling: cell death responses and AtRGS1 phospho-barcode(Universidade Federal de Viçosa, 2024-01-30) Simoni, Eduardo Bassi; Reis, Pedro Augusto Braga dos; http://lattes.cnpq.br/4529646883285257Plant adaptation/acclimatation relies on the perfect adjustment of the organism and the environment interaction, requiring a complex and robust cooperation among different players. Any alteration in this interaction can disrupt the cell homeostasis, activating various responses. From signal perception to gene expression regulation and subsequently cell fate control, intricate signaling cascades play essential roles in these processes, facilitating communication among diverse organelles. In the present work, we aimed to describe and seek elucidating factors that are involved in specific cell signaling, as well as their function in the perception, propagation, and the response to an environmental signal. Firstly, in the first chapter titled “Cell death signaling from endoplasmic reticulum stress: plant-specific and conserved features'', we reviewed the main aspects of the endoplasmic reticulum (ER) stress signaling and its evolutionary conservation in plant organisms, focusing on the different cell death signaling activated by ER stress responses. The ER is an important organelle responsible for controlling the correct folding and post-translational modification of secretory proteins, Ca2+ homeostasis and protein quality control. Under normal conditions the ER protein dynamic is stabilized by the rate of synthesis/folding and organelle loading system. However, when the correct balance is disrupted, it starts accumulating unfolded proteins and, thus, triggers signaling pathways to restore the normal condition, such as the unfolded protein response (UPR). The unfolded protein accumulation can be triggered by many different conditions, such as biotic and abiotic stresses. To restore the perfect balance in the ER four main processes are stimulated: decreasing the protein synthesis rate; an increase in the ER chaperone expression; positive modulation of ERAD genes; expansion of ER internal capacity. Those mechanisms can be modulated by two main branches that are associated with ER-membrane- bound proteins: IRE1 and bZIP transfactors. The molecular chaperone BiP, also plays an important role in the signaling modulation, acting as chaperone and sensor of the stress. Thus, the combination of different factors and responses allow the cell to cope with ER stress in order to maintain the cell function and survival. However, prolonged stress conditions that cannot be restored may trigger autophagy or programmed cell death (PCD) responses originating from the ER, enabling organism survival at the expense of specific cells. Plant PCD shares conserved and unique signaling pathways capable of modulating, activating, and executing the cell death process. A unique plant response involves NAC (NAN/ATAF/CUC) transcription factor family modules, which can include: the DCD/NRP-mediated cell death component; bZIP28/bZIP60- ANAC089-mediated cell death component; ANAC013/ANAC017 component. Collectively, these diverse mechanisms are important in cell homeostasis, by perceiving, propagating, and activating specific responses in order to maintain the organism's survival. Likewise, another conserved signaling pathway was studied in Chapter 2 titled “Revealing the impact of AtRGS1 residues phosphorylation in the plant cell signaling”. In this chapter we seek to understand the effect of post-translational modifications on RGS1, and their role on the structure and function of AtRGS1. Heterotrimeric G-proteins, vital for growth, development, stress responses, and pathogen defense, are negatively regulated by the seven-transmembrane Regulator of G-protein signaling (7TM-RGS) instead of GPCRs found in animals. Arabidopsis AtRGS1, with its C-terminus serine phosphorylation cluster, detaches from the G- protein alpha subunit (AtGPA1) upon phosphorylation, activating beta-arrestin-like endocytosis and G-signaling cascades. Beyond the cluster, AtRGS1 has serine residues at the RGSbox terminus (Ser417) and linker region (Ser278), often overlooked due to the focus on truncated forms. Our molecular dynamics simulations (MDS) on a plant plasma membrane model show that phosphorylation in the linker region controls RGS domain positioning via hydrogen bonds with RGSbox residues. This mechanism, consistent in the phospho-mutant S278E, is also seen in lycophytes, suggesting a conserved regulatory pattern. In vivo Split Firefly Luciferase (SFluc) assays revealed that the S278E variant, mimicking phosphorylated S278, exhibits reduced interaction with AtGPA1 compared to wild type. Additional MDS and SFluc analysis with several phosphomimetic mutants of both proteins indicated that concurrent phosphorylation of S278 in AtRGS1 and Y166 in AtGPA1 is necessary for stable interaction, pointing to a complex interplay of phosphorylation events in plant G protein regulation. Our findings also demonstrate that phosphorylation of S278 is a pivotal modulator in the internalization, stability and nuclei translocation processes. Finally, S278 residue has an important role in the anti-bacterial immune system response. Collectively, these results suggest that the phosphorylation pattern of AtRGS1, especially S278 and cluster, acts as a barcode directing responses to various elicitors, influencing membrane domain positioning and overall signaling processes. Keywords: UPR; ER-stress; Programmed cell-death; RGS1; G-signaling; Phosphorylation; Structure; Internalization.Item Classificação e anotação in silico de genomas virais relacionados ao filo Cressdnaviricota(Universidade Federal de Viçosa, 2023-05-02) Gomes, Ruither Arthur Loch; Zerbini, Francisco Murilo; http://lattes.cnpq.br/6476684270507219Os vírus afetam ciclos biogeoquímicos e infectam organismos em todos os ambientes da terra. Avanços em diferentes tecnologias, como o sequenciamento de alto rendimento e a biologica computacional, trouxeram luz sobre a real diversidade e abundância dos vírus. Uma das consequências mais importantes foi a descoberta de um imenso número de sequências virais, porém sem similaridade com vírus previamente caracterizados. Enquanto a classificação taxonômica dos vírus havia sido feita por décadas com base em características fenotípicas, essa nova realidade gerou a necessidade da utilização direta das sequências, mesmo na ausência de qualquer informação biológica, para a classificação taxonômica. Com esse novo panorama de farta disponibilidade de dados de sequência, avanços no poder computacional e de aprendizado de máquina surgiram como ferramentas essenciais para classificação e anotação das sequências derivadas desse "dilúvio de dados". Diversas ferramentas computacionais vêm sendo propostas e desenvolvidas usando diferentes abordagens para trabalhar com esses dados, e o aprendizado de máquina vem se destacando por sua alta acurácia de predição. Na taxonomia, diferentes abordagens vem sendo aplicadas para grupos específicos de vírus, e só recentemente foi desenvolvido um algoritmo, VirusTaxo, para classificação taxonômica de todos os tipos de vírus com acurácia considerável. Entre as diversas famílias de vírus, algumas se enquadram dentro de um grupo de vírus com genomas de DNA de fita simples circulares e pequenos, que codificam uma proteína relacionada à replicação que é relativamente conservada entre seus membros. Esses vírus, classificados no filo Cressdnaviricota, são exemplares interessantes para se avaliar métodos in silico de classificação e análise de funções gênicas. Assim, na primeira parte desse trabalho, foi avaliada a capacidade das redes neurais convolucionais para classificar taxonomicamente os cressdnavírus. Foi possível obter uma acurácia nos dados de teste superior ao VirusTaxo, a ferramenta com maior capacidade de predição taxonômica atualmente. Na segunda parte, foram utilizadas ferramentas computacionais para identificar possíveis pequenas ORFs funcionais em alfassatélites associados a begomovírus que possam estar relacionadas a variações de sintomas observadas entre alfassatélites do Novo Mundo e do Velho Mundo e foi possível identificar duas pequenas ORF com domínios funcionais preditos. Palavras-chave: Vírus, Cressdnaviricota, bioinformática, machine learningItem Marcadores moleculares associados a resistência da soja a fitonematoides(Universidade Federal de Viçosa, 2023-04-26) Xavier, Yan Pablo Moreira; Costa, Maximiller Dal-Bianco Lamas; http://lattes.cnpq.br/0297028341324221A cultura da soja a cada nova safra se depara com um gargalo cada vez maior, que são os fitonematoides. O nematoide das lesões radiculares (Pratylenchus brachyurus) é um grande causador de perdas para as lavouras. Entretanto, na literatura, poucas regiões gênicas são associadas à resistência a este fitonematoide. Outro nematoide que vem sendo descrito como possível parasita e causador de danos na cultura é o nematoide espiralado (Helicotylenchus dihystera). Neste sentido, a tese visa validar marcadores de DNA associados à resistência para os respectivos nematoides em soja. No primeiro capítulo, marcadores SNPs (Single-Nucleotide Polymorphisms) foram identificados e associados à resistência ao nematoide espiralado para 34 genótipos de soja e a resposta de oito cultivares selecionadas do banco de germoplasma do Programa de Melhoramento da Qualidade da Soja – Universidade Federal de Viçosa (PMQS-UFV) frente a presença ou ausência do parasita até o período de colheita. A cultivar TMG1176 RR apresentou maior número de SNPs associados e menor reprodução de nematoides. Ao todo, 21 SNPs foram associados com a característica de resistência ao fitonematoides emergente, deste total, 11 SNPs apresentaram proximidade de até ±2Mb com outro SNP associado com a resistência a outros fitonematoides em soja. No segundo capítulo, foram três SNPs validados associados à resistência ao nematoide das lesões radiculares, em duas populações de RILs (Recombinant Inbred Lines). Os SNPs 145 e 149 apresentaram associação a loci para resistência ao nematoide das lesões radiculares de 11 e 9%, respectivamente, no cruzamento entre CD213 PTA x BR8014887. O cruzamento entre BRS284 x BR8014887 apresentou a importância de 33 e 14% para característica de resistência ao nematoide das lesões radiculares, respectivamente para os SNPs 145 e 149. O SNP 255 para ambos os cruzamentos apresentou associação a um locus com menor participação para resistência ao nematoide, porém o cruzamento BRS284 x BR8014887 apresentou associação superior a 10%. A avaliação da combinação para as três marcas indicou determinação para resistência ao nematoide das lesões radiculares de 30% para a população descendente do cruzamento CD213 PTA x BR8014887 e 47,5% para a população descendente do cruzamento BRS284 x BR8014887. O ciclo fenológico da população BRS284 x BR8014887 apresentou variância para o SNP149 no qual a parcela com a presença do alelo AA apresentou maturação precoce em relação ao alelo GG. Palavras-chave: Nematoide Melhoramento genético. SNP. espiralado. Nematoide das lesões radiculares.Item Suscetibilidade de bactérias isoladas de dermopatias caninas a extratos foliares de Eugenia astringens (Cambess) e formulações tópicas(Universidade Federal de Viçosa, 2023-02-28) Quaresma, Lizandra das Neves; Ribon, Andréa de Oliveira Barros; http://lattes.cnpq.br/4844393275276824Bactérias patogênicas são frequentemente associadas a infecções de pele em cães, podendo agravar o quadro do animal e levar ao aumento da mortalidade. Algumas dessas bactérias desenvolveram resistência a antibióticos comumente utilizados em terapias para o tratamento de dermopatias em cães, dificultando o processo de tratamento e reabilitação do animal. O uso de fitoterápicos vem sendo integrado ao tratamento dessas doenças devido ao seu potencial terapêutico e baixos efeitos colaterais. Este trabalho teve por objetivo caracterizar extrato bruto e fração hexânica preparada de folhas de Eugenia astringens (Cambess) e avaliar a atividade antimicrobiana do material vegetal sobre bactérias de dermopatias caninas. Foi detectada por cromatografia gasosa a presença de compostos sesquiterpenos (cariofileno e α- amorfeno) no extrato bruto e uma mistura de compostos hidrocarbonetos na fração hexânica. Das bactérias isoladas de cães assistidos pelo Hospital Veterinário de Uberaba, Minas Gerais, oito foram Gram- positivas e 17 Gram-negativas. Entre as bactérias identificadas estão Escherichia coli, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus pseudintermedius, Staphylococcus aureus, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Kosakonia cowani, Enterobacter hormaechei, Enterococcus faecium, Streptococcus dysgalactiae e Klebsiella pneumoniae. As bactérias Gram-positivas mostraram-se sensíveis a todos os antibióticos testados enquanto que uma maior taxa de resistência foi vista entre as Gram- negativas, muitas das quais foram multirresistentes. O extrato bruto e fração hexânica de E. astringens foi efetivo contra todas as bactérias Gram-positivas testadas, porém não tiveram efeito sobre as bactérias Gram-negativas. Duas formulações tópicas antibacterianas foram produzidas a partir da fração hexânica de E. astringens que tiveram forte potencial de inibição de crescimento nas bactérias Gram-positivas. Em conclusão, o extrato bruto e a fração hexânica de E. astringens apresentaram forte atividade antibacteriana contra bactérias Gram-positivas revelando o potencial de E. astringens como fonte de metabólitos que podem ser utilizados na preparação de pomadas fitoterápicas tópicas, tornando-se fortes aliadas no tratamento de problemas depele em cães. Palavras-chave: Atividade antibacteriana. Fração hexânica. Formulação tópica.Item Avaliação da inibição da nucleosidio trifosfato difosfohidrolase de Trypanosoma cruzi (TcNTPDase1) por compostos sintéticos não naturais derivados da ent-isoquercetina(Universidade Federal de Viçosa, 2023-01-12) Ribeiro, Isadora Cunha; Fietto, Juliana Lopes Rangel; http://lattes.cnpq.br/6527501000089483A Doença de Chagas é uma doença tropical negligenciada causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi. O arsenal terapêutico para tratamento é muito restrito, com efeitos colaterais importantes e ação limitada dependendo da fase da doença e de variações das cepas do parasito. Sendo é importante o desenvolvimento de novos fármacos. T. cruzi possui em sua superfce uma Ecto-Nucleosídio Trifosfato Difosfohidrolase (E-NTPDase) denominada TcNTPDase1. Já foi demonstrado que a TcNTPDase1 possui papeis importantes para a virulência, infecciosidade e adesão do parasito à célula do hospedeiro mamífero, sendo um potencial alvo para o desenvolvimento de novos medicamentos para tratamento da Doença de Chagas. A quercetina é um flavonóide conhecido por seu papel antioxidante e anti- inflamatório e seu potencial como inibidor de E-NTPDases já foi demonstrado. Este trabalho teve como objetivo a busca de inibidores da TcNTPDase1 recombinante expressa em bactéria. Foram avaliados seis compostos sintéticos (denominados 2, 4, 14, 15, 16 e 17) derivados não naturais da ent-isoquercetina, bem como a quercetina e a miquelianina (derivado natural da quercetina). No capítulo I, apresentamos o artigo que reúne os dados de síntese e de avalição como inibidores desses compostos. A quercetina e miquelianina inibiram a enzima em cerca de 50%. Já 16 apresentou a maior capacidade de inibição (96%) e por cinética enzimática determinou-se inibição do tipo competitiva com Ki de 8,385 µM. Por fim, analisamos a interação do composto 16, o melhor inibidor, com a enzima por docking molecular, verificando o composto 16 interagiu no sitio ativo da enzima e apresentou interações com resíduos considerados importantes para a atividade catalítica da TcNTPDase1. No capítulo II apresentamos a patente “Compostos derivados da ent-isoquercetina, processos de produção e uso como inibidor de NTPDases e em medicamentos para o tratamento da doença de Chagas e Leishmanioses” depositada em maio de 2022. Este trabalho demonstra pela primeira vez que derivados da ent-isoquercetina possuem ação inibitória de ENTPDases podendo ser aplicados no desenvolvimento de fármacos ou de inibidores específicos para uso em terapêutica E- NTPDase alvo dependente.Palavras-chave: Doença de Chagas. E-NTPDases. TcNTPDase1. Inibidores. Quercetina.Item Biotechnological applications of yeasts: stress responses of Spathaspora passalidarum and mode of action of the biocontrol agent Pseudozyma flocculosa(Universidade Federal de Viçosa, 2023-04-12) Albuini, Fernanda Matias; Fietto, Luciano Gomes; http://lattes.cnpq.br/4678957572249715Yeasts are biodiverse microorganisms that present several biotechnological applications, such as in bioethanol production and biological control of plants against fungal pathogens. The first two chapters of this thesis focused on studying the mechanisms underlying the stress responses of Spathaspora passalidarum, a yeast capable of fermenting xylose into ethanol, and the third chapter aimed to investigate the mode of action of Pseudozyma flocculosa, a natural antagonistic yeast of powdery mildew fungi. In the first study, an RNA-seq experiment was performed with S. passalidarum cells exposed to 2 h of 4% (v/v) ethanol stress. The bioinformatics analyses supported that S. passalidarum activated responses regarding protein folding and antioxidant stress. However, the osmotic stress response of this yeast appeared impaired, and genes encoding proteins from lipid metabolism, transporters, and enzymes from glycolysis and fermentation pathways showed downregulation. Additionally, ethanol-treated cells presented a pseudo-hyphal morphology. Changes in fatty acid profile were only observed after 12 h of ethanol exposure, coinciding with the yeast recovery of its xylose consumption ability. Thus, the halt in nutrient acquisition and fermentation, the lack of fast membrane adjustments, and the limited osmotic stress response were the main aspects identified underlying the low ethanol tolerance of S. passalidarum. In the second study, comparative genomic analyses were performed with Spathaspora passalidarum and Saccharomyces cerevisiae searching for clues regarding their distinct robustness to stresses. The results showed major differences in transcription factor sequences while signaling pathways and responsive proteins appeared conserved between the yeasts. The evolutionary differences in transcription factors might contribute to distinct stress responses and, ultimately, different physiological profiles. Indeed, our results showed that S. passalidarum and S. cerevisiae present distinct tolerance profiles to ethanol, oxidative, and osmotic stresses. The overexpression of the MSN-like transcription factor of S. passalidarum in an S. cerevisiae msn2 msn4 double-deleted strain indicated that the MSN-like only partially complemented the function of their orthologs in S. cerevisiae under stress, corroborating our hypothesis that transcription factors have diverged in S. passalidarum and it might have impacted the yeasts stress responses. In the third study, the role of the Pf2826 effector of Pseudozyma flocculosa was investigated in the yeast biocontrol activity against barley powdery mildew. This gene is highly expressed only during the P. flocculosa- barley-powdery mildew tripartite interaction. The knockout of this gene using the CRISPR-Cas9 mediated genome edition tool showed that the mutant line developed less aggressively and did not overtake the powdery mildew colonies, indicating that this gene is essential for the full biocontrol activity of P. flocculosa. The yeast-two- hybrid methodology was used to validate the interaction of the Pf2826 effector with seven putative interactors previously identified by a pull-down assay. The results confirmed the interaction of the Pf2826 effector with a barley pathogenesis-related protein that has putative roles in plant defense against biotic stress, and with a powdery mildew effector, which might be involved in the pathogen’s aggressiveness. These interactions probably destabilize the effector-induced host immunity suppression and boost the plant defenses, resulting in the collapse of the powdery mildew colonies. Keywords: Yeast biotechnology. Bioethanol production. Biological control.Item Prospecção tecnológica e desenvolvimento de estratégias de diagnóstico de leptospirose(Universidade Federal de Viçosa, 2022-07-15) Gonçalves, Victor Hugo Sousa; Bressan, Gustavo Costa; http://lattes.cnpq.br/0200670915699187A leptospirose é uma doença infecciosa febril causada por variedades patogênicas do gênero Leptospira, e é considerada uma das zoonoses de maior projeção mundial. Os roedores são os principais reservatórios dessas bactérias, mas outros animais silvestres e domésticos, como equinos, bovinos e cães, também participam da sua transmissão, que se dá principalmente através do contato com a urina de indivíduos infectados. Apesar do crescente interesse na área, ainda ha uma falta de alternativas acessíveis e eficientes para o diagnóstico de leptospirose em cães. Assim, neste trabalho propomos a utilização de duas proteinas quiméricas como antígenos para o diagnóstico sorológico de leptospirose canina. As proteinas recombinantes foram produzidas em E. coli, e recuperadas purificadas com rendimento de 4,467 e 77,957 mg/L. Foi empregado a técnica de ELISA indireto, utilizando ambas as quimeras como antígeno, para detectar anticorpos dos tipos IgG e IgM em amostras de soro. Resultados de MAT das amostras foram utilizados como referência para avaliação da eficiência do diagnóstico por ELISA. Foram avaliadas diferentes condições para o diagnóstico, e a acurácia geral dos ensaios variou de 57 à 80 %, sendo que a capacidade de predição de valores positivos foi de aproximadamente 85 % para IgG e 75 % para IgM. Demonstramos assim que as quimeras construídas apresentam potencial para auxiliar no diagnóstico de leptospirose canina. Além disso, foi construído um patent landscape com objetivo de descrever o cenário de desenvolvimento de soluções biotecnológicas para o campo de doenças infecciosas caninas. Esses dados demonstraram a relevante participação das instituições de ensino públicas no desenvolvimento de produtos de biotecnologia, e reforçaram a importância das parcerias público-privadas no avanço científico. Palavras-chave: Leptospira. Leptospirose em animais. Diagnóstico. Ensaio de imunoabsorção enzimática.Item Identification and characterization of CFEM Proteins from Phakopsora pachyrhizi, the Asian soybean rust fungus(Universidade Federal de Viçosa, 2023-02-14) Holtman, Valéria Cristina; Fietto, Luciano Gomes; http://lattes.cnpq.br/8712503195160145Asian soybean rust (ASR) caused by the fungus Phakopsora pachyrhizi is one of the main fungal diseases of soybean, which can cause losses of up to 95% of production under favorable environmental conditions and abundant inoculum. This pathogen is an obligate, biotrophic parasite that during the infection process secretes several effector proteins that suppress plant defense responses and promotes parasitism. One of the characteristics of fungal and oomycete effector proteins is the high content of cysteine residues (>3%). CFEM proteins (Common in Several Fungal Extracellular Membrane Proteins) are proteins secreted by different fungi species with a protein domain with 8 cysteine residues in conserved positions and diverse cellular functions. The best characterized CFEM proteins are Csa2, Rbt5, and Pga7 from the fungus Candida albicans, that are involved in a cascade to capture and absorb heme-iron from the mammalian host. The objectives of this study were to identify and characterize all CFEM proteins present in the repertoire of P. pachyrhizi fungus and to understand the biological function of these proteins as membrane component, immunity suppressor or iron capture in the pathogen life cycle. In silico analysis showed that P. pachyrhizi has 10 CFEM proteins (PpCFEM1-PpCFEM10), six of which are predicted to be secreted soluble proteins (PpCFEM1, 5, 7, 8, 9, 10) and four (PpCFEM2, 3, 4, 6) predicted as extracellular proteins with Glycosylphosphatidylinositol (GPI) docking site. Seven of the CFEM protein-coding genes (PpCFEM1-7) were expressed in the period 0 to 96 hours post-inoculation; PpCFEM2, 5, and 6 showed higher expression in the time of zero hours post-inoculation (hpi), and PpCFEM3 and 4 are expressed at 24 hpi. PpCFEM1, 3, 5, and 7 were identified in the nucleus and cytoplasm in subcellular localization assays, PpCFEM2 and PpCFEM6 proteins were identified in the cell membrane, and PpCFEM4 showed no defined subcellular localization. PpCFEM1, 4, 5, and 7 were able to suppress PTI (immunity triggered by recognition of PAPMPs), whereas only the PpCFEM4 protein was also able to suppress ETI (immunity triggered by recognition of effectors) in Nicotiana benthamiana leaves. The PpCFEM proteins did not present homology with the C. albicans CFEM proteins that participate in the heme-iron capture and absorption mechanism, and tertiary structure conformation analyses indicated that the PpCFEM proteins did not present the necessary structure for the heme-iron coordination as present in C. albicans CFEM proteins. Our findings suggest that the PpCFEM1, 4, 5, and 7 proteins can present effector molecule functions, and PpCFEM2, 3, and 6 proteins could present structural functions in the cellular process that occurs at the beginning of the infectious process. CFEM-based heme-iron capturing and absorption mechanism in P. pachyrhizi was not observed. Keywords: CFEM proteins. Phakopsora pachyrhizi. Functional characterizationItem New insights on begomoviruses: Virus-virus interactions in mixed infections and estima- tion of genetic bottlenecks during vector transmission(Universidade Federal de Viçosa, 2023-01-31) Barbosa, Tarsiane Mara Carneiro; Zerbini Júnior, Francisco Murilo; http://lattes.cnpq.br/6301152112174709Yield losses in tomato crops caused by a begomovirus complex are observed in all the main producing regions of Brazil. In this work, aspects related to interactions in mixed infection and genetic bottlenecks during transmission by the insect vector were explored. Previous studies revealed a complex interaction between the begomoviruses tomato rugose mosaic virus (ToRMV) and tomato severe rugose virus (ToSRV), in which ToRMV negatively interferes with ToSRV infectivity and accumulation. Differences in the Rep protein and in the common region (CR) sequence may be involved in the preferential replication of ToRMV components during mixed infection. Thus, we used previously constructed clones for ToSRV DNA-A con- taining the same nucleotides that occur in ToRMV at divergent positions in the CR and IRD domain of the Rep protein. ToSRV infectivity and viral accumulation in single infection were not affected by any of the nucleotide changes. In a mixed infection with ToRMV and ToSRV- A (ToR:CR) , high infectivity and DNA accumulation of ToSRV (ToR:CR) , similar to wild-type ToSRV, were observed. This was not the case when plants were inoculated with ToRMV and ToSRV-A (ToR:IRD) . These results suggest that CR nucleotides act as specific recognition sites for Rep binding, increasing the rate of viral replication and viral DNA accumulation. The emer- gence of begomoviruses over the last few decades is related to the worldwide spread of white- flies of the Bemisia tabaci complex. Although vector transmission is considered an important genetic bottleneck for plant viruses, few studies have attempted to estimate its magnitude. To assess the occurrence and magnitude of genetic bottlenecks during vector transmission of be- gomoviruses, B. tabaci Middle East-Asia Minor 1 (MEAM1) was subjected to acquisition pe- riods of 24 h and 48 h in tomato plants and Euphorbia heterophylla infected by ToSRV and Euphorbia yellow mosaic virus (EuYMV), respectively. The insects were collected and dis- sected to obtain the midgut (MG) and salivary glands (SG). Total DNA of each organ was extracted, enriched through RCA and sequenced. A larger number of sequence reads mapped to EuYMV and ToSRV reference genomes in the MG sample compared to SG samples, con- sistent with the higher viral load in the MG reported in the literature. The analysis of SNPs indicated a significant number of deletions in the EuYMV MG sample and a high number of nucleotide substitutions in the SG samples. Estimates of Shannon's entropy also indicated a greater degree of genetic variability of the SG samples. Our results suggest that the midgut imposes a genetic bottleneck in B. tabaci MEAM1, but that the genetic variability of the viral population is restored during passage through the salivary glands. Keywords: Geminivirus. Plant Virus. WhiteflyItem Avaliação do silenciamento de SRPK por CRISPR/Cas9 e da interação com EFHD2 em melanoma metastático murino(Universidade Federal de Viçosa, 2020-02-28) Caetano, Mônica Maria Magalhães; Bressan, Gustavo Costa; http://lattes.cnpq.br/6186407627893168As proteínas cinases serina/arginina (SRPK) são classicamente relacionadas à regulação do splicing do pré-mRNA pela fosforilação de fatores de splicing ricos em dipeptídeos serina e arginina, as proteínas SR. É evidente a importância de estudos que visem elucidar os mecanismos moleculares da atuação das SRPK em diversas vias de sinalização, splicing do pré-mRNA e outros processos celulares, sobretudo relacionados ao desenvolvimento do câncer e formação de metástase, nos quais essas cinases já foram identificadas superexpressas. Neste trabalho, avaliamos o impacto do silenciamento de SRPK em melanoma metastático murino. O silenciamento de SRPK2 na linhagem celular de melanoma, B16F10, prejudicou o desenvolvimento do tumor subcutâneo e a formação de nódulos pulmonares in vivo e diminuiu a proliferação e a invasão celular in vitro. A supressão da expressão de SRPK1 e SRPK2, simultaneamente, diminuiu a capacidade de formação de colônias de B16F10. O mecanismo de ação de SRPK2 no desenvolvimento do melanoma parece estar relacionado à sua atuação na dinâmica de polimerização do citoesqueleto de Actina, pois o silenciamento de SRPK2 diminuiu a formação de F-actina nas células B16F10. Um ensaio de duplo-híbrido em leveduras, realizado anteriormente pelo nosso grupo de pesquisa, mostrou a possível interação entre a região espaçadora de SRPK2 e proteínas relacionadas à regulação do citoesqueleto de Actina. Dentre elas, EFhd2 está envolvida na regulação da dinâmica de polimerização do citoesqueleto de actina e formação de metástase em melanoma. Neste trabalho a interação entre SRPK2 e EFhd2 foi confirmada pelos ensaios de co-imunoprecipitação e GST-pulldown. Ensaios de fosforilação in vitro mostraram que EFhd2 pode ser fosforilada por SRPK2. Portanto, com os resultados obtidos até o momento, é possível sugerir que a diminuição da capacidade metastática de B16F10 em decorrência da supressão da expressão de SRPK2 pode envolver, pelo menos parcialmente, alterações na dinâmica do citoesqueleto de Actina via EFhd2. Esses dados criam novas perspectivas sobre o entendimento da relação funcional entre SRPK2 e a dinâmica do citoesqueleto de Actina no contexto do melanoma metastático e potencialmente em outros tipos de tumores. Palavras-chave: Serine/arginine protein kinase. Melanoma. Metástase.