Bioquímica Aplicada
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Item Lipoproteína de Staphylococcus aureus: expressão e participação na invasão de células MAC-T em condições encontradas na glândula mamária bovina(Universidade Federal de Viçosa, 2024-08-27) Canizo, Yasmim do Nascimento; Ribon, Andréa de Oliveira Barros; http://lattes.cnpq.br/5065715346710729Lipoproteínas são proteínas de membrana encontradas em S. aureus que exercem diversas funções celulares e estão relacionadas à patogenicidade bacteriana. Um grupo especial de lipoproteínas, denominadas lipoproteínas-like (lpls) vem sendo associado à invasão em células humanas. Essas proteínas são codificadas por genes que estão organizados em um cluster localizado em uma ilha de patogenicidade. Um estudo realizado por nosso grupo identificou no genoma de S. aureus 302, cepa isolada de mastite bovina subclínica, um cluster contendo 6 lpls que têm uma identidade superior a 80%, porém baixa homologia com as lpls de S. aureus RF122, cepa associada à mastite clínica severa. Para avaliar o papel da Lpl na invasão de células imortalizadas do epitélio mamário bovino (MAC-T), uma Lpl de SAU302 foi expressa em Escherichia coli C41 e purificada por cromatografia de afinidade. O sequenciamento do clone comprovou a clonagem do gene de interesse. A proteína recombinante de 31 kDa foi expressa nas frações solúvel e insolúvel. Para os ensaios de invasão, células MAC-T foram incubadas por uma hora com concentrações de 35 a 4.375 µg/mL de lipoproteína recombinante antes da adição da bactéria. Observou-se que apenas as concentrações de 35 e 17,5 µg/mL aumentaram significativamente a invasão em 87% e 53%, respectivamente. Células MAC-T foram incubadas com S. aureus 302 por 30 minutos, 1:30 h e 3 h em meio DMEM contendo 0,6 mM de bipiridina (quelante de ferro), 0,6 mM de bipiridina e concentrações subinibitórias (0,5xCIM) de ampicilina, ciprofloxacina e gentamicina. No tempo de 30 minutos, houve diminuição de até 62% na invasão em todas as condições, quando comparadas ao controle. No tempo de 1 hora e 30 minutos, apenas o acréscimo de bipiridina causou diminuição significativa na invasão. No tempo de 3 horas, a combinação de bipiridina e ciprofloxacina e bipiridina e gentamicina diminuiu a invasão em 77,61% e 81,96%, respectivamente. Para analisar a expressão dos genes lpls, a cepa S. aureus 302 foi cultivada em diferentes condições de estresse, em meio BHI. A extração do RNA total foi feita da cultura na fase de crescimento estacionária, seguida de síntese do cDNA com random primers e RT-qPCR com primer complementar a todos os genes lpls. Observou-se que o acréscimo de bipiridina 0,6 mM, de concentrações subinibitórias de ciprofloxacina e o cultivo da bactéria a 39 ºC com ou sem presença de bipiridina 0,6 mM diminuiu significativamente a expressão dos genes lpls. O acréscimo de bipiridina 0,6 mM e concentrações subinibitórias de ampicilina, ciprofloxacina e gentamicina juntos diminuiu drasticamente a expressão. Os resultados confirmam a expressão de uma Lpl de S. aureus e sugerem que ela promove a invasão bacteriana. Este trabalho foi o primeiro a avaliar a expressão de genes que codificam lpls em condições que simulam o ambiente encontrado pela bactéria e sugere que a lipoproteína auxilia na invasão de células mamárias do epitélio bovino. Palavras-chave: Lipoproteína; Invasão celular; Expressão gênica.