Bioquímica Aplicada
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Item Desvendando o secretoma do fungo fitopatogênico Chrysoporthe cubensis LPF-1 cultivado em biomassa lignocelulósica como potencial fonte de enzimas para produção de bioetanol(Universidade Federal de Viçosa, 2019-07-08) Tavares, Murillo Peterlini; Guimarães, Valéria Monteze; http://lattes.cnpq.br/0505206837779243A crescente preocupação com a escassez de combustíveis fósseis e o aumento da emissão de gases do efeito estufa, tem resultado no aumento do interesse em nível global por fontes de energia alternativas que sejam sustentáveis. Esforços têm sido feitos para atingir esses objetivos, como o desenvolvimento de tecnologias que utilizam a biomassa de resíduos agroindustriais para a produção de biocombustíveis. Nesse contexto, o Brasil se destaca como o maior produtor de cana-de-açúcar do mundo. A utilização da biomassa lignocelulósica proveniente do bagaço de cana-de-açúcar para a produção de etanol de segunda geração torna-se uma alternativa promissora para a redução dos impactos ambientais provenientes do uso de combustíveis fósseis. Considerando o processo de conversão bioquímica de biomassa em etanol, a hidrólise enzimática é normalmente referida como a etapa limitante, devido ao custo elevado de enzimas comerciais. Dessa forma, o desenvolvimento de bioprocessos para produção das enzimas on-site e estratégias para aumentar o rendimento final da hidrólise enzimática são necessários para assegurar que a conversão de biomassa se torne financeiramente viável em etapas de produção em larga escala. Uma vez que o extrato enzimático do fungo fitopatogênico Chrysoporthe cubensis LPF-1 apresentou elevada eficiência para sacarificação da biomassa lignocelulósica em diferentes abordagens, tornou-se essencial conhecer detalhadamente as enzimas e proteínas secretadas por este fungo, especialmente aquelas envolvidas na hidrólise de biomassa. Para tanto, o objetivo deste trabalho foi caracterizar pela primeira vez os perfis proteicos produzidos e secretados por C. cubensis crescido em estado semi-sólido tendo o farelo de trigo ou bagaço de cana-de açúcar como fontes de carbono, e realizar a integração de predições in silico obtidas por ferramentas computacionais com os dados de proteômica obtidos por espectrometria de massas. A integração dos resultados computacionais com os dados proteômicos possibilitou o aumento da identificação das proteínas secretadas e a previsão de todo o potencial de secreção do fungo que pode ser induzido por outras fontes de carbono ou condições de cultivo, evidenciando seu real potencial como microrganismo produtor de lignocelulases. O presente trabalho demonstrou que C. cubensis foi capaz de secretar um maior número e variedade de enzimas ativas em carboidratos do que microrganismos reconhecidamente consideradas excelentes fontes de enzimas industriais, como os fungos do gênero Aspergillus e Penicillium. Também foi observado que C. cubensis apresentou composição do secretoma com características exclusivas de acordo com a fonte de carbono ao qual foi cultivado, revelando uma grande plasticidade no perfil de secreção enzimática do fungo. C. cubensis é capaz de produzir diferentes coquetéis enzimáticos eficientes que podem ser aplicados em uma variedade de biomassas lignocelulósica com características distintas, o que normalmente não é encontrado em produtos comerciais que possuem composição definida e aplicação restrita às biomassas comumente utilizadas. Além disso, C. cubensis foi capaz de secretar famílias de enzimas que têm sido extensivamente estudadas como alvos de grande interesse biotecnológico, como as oxidases de multi- cobre (MCOs). C. cubensis foi capaz de secretar duas MCOs quando cultivado em uma mistura de farelo de trigo e casca de laranja na proporção 3:1. A fração purificada contendo as duas MCOs catalisou a oxidação dos compostos fenólicos produzidos pelo pré-tratamento alcalino do bagaço de cana-de-açúcar, o que resultou em melhores rendimentos de sacarificação deste material, demonstrando serem enzimas promissoras para aplicações em hidrólise de biomassa e de grande potencial biotecnológico. Dessa forma, C. cubensis emerge como alternativa promissora para a produção de enzimas lignocelulolíticas clássicas e como fonte de novos alvos enzimáticos para a indústria de bioetanol.Item Caracterização molecular da interação das cigarrinhas-das-pastagens (Mahanarva spectabilis) com diferentes forrageiras(Universidade Federal de Viçosa, 2019-07-30) Monteiro, Luana Pereira; Oliveira, Maria Goreti de Almeida; http://lattes.cnpq.br/0459373882356070A cigarrinha-das-pastagens, Mahanarva spectabilis (Distant,1909) é a principal praga em forrageiras na América Tropical, promovendo danos severos às pastagens, e comprometendo a produção de produtos de origem animal. O Brasil possui o maior rebanho comercial do mundo, e para garantir baixos custos na produção, usa as pastagens como a principal fonte de alimentação do rebanho. Em decorrência de ataques de insetos- praga, o nível de produtividade das pastagens pode sofrer declínio tanto na quantidade quanto na qualidade de produção. A seleção de cultivares de forrageiras resistentes, é uma alternativa de controle promissora, uma vez que o controle químico das cigarrinhas é economicamente inviável. São escassos os trabalhos que relatam a bioquímica da interação entre M. spectabilis com diferentes forrageiras. O objetivo, na primeira parte do trabalho, foi identificar as proteínas, metabólitos e hormônios presentes nas glândulas salivares quando a M. spectabilis se alimenta de plantas de capim- elefante (Cenchrus purpureus), cv. Roxo Botucatu e cv. Pioneiro, Brachiaria brizantha cv. Marandú e Brachiaria decumbens cv. Basilisk. Na segunda parte, objetivamos elucidar as possíveis respostas metabólicas nas forrageiras Brachiaria brizantha, Brachiaria decumbens, capim-elefante (Cenchrus purpureaus) cv. Roxo-de-Botucatu e cv. Pioneiro quando infestadas por M. spectabilis. Através das análises de proteômica foi possível identificar proteínas envolvidas em processos como controle da musculatura, síntese e metabolismo protéico, proteção contra estresse biótico/abiótico e termoregulação. As análises fitohormonais das glândulas salivares indicam uma variação nos níveis hormonais em função do tipo de forrageira usada na alimentação. Foram detectados nos componentes das glândulas salivares a presença de efetores, tais como ácidos graxos de cadeia longa que podem induzir ou suprimir as respostas de defesa das plantas. A presença dos efetores afetam as respostas de defesa da planta para permitir o melhor desempenho do inseto na infestação das plantas. De frente a esses resultados, nos é permitido propor que alguns efetores presentes nas glândulas salivares de cigarrinha das pastagens possam ser responsáveis por suprimir a resposta de defesa da planta, tornando-se uma estratégia bem sucedida do inseto na colonização do hospedeiro. Palavras-chave: Cigarrinha-das-pastagens. Glândula salivar. Proteômica. Interação planta-praga.Item Análise proteômica de cristalino de Felis catus(Universidade Federal de Viçosa, 2018-06-27) Silva, Maria José de Jesus; Siqueira, Cláudio Lísias Mafra de; http://lattes.cnpq.br/1623841808530496O Cristalino, ou lente, é uma peça chave para o olho de qualquer ser vivo. A lente foca a luz na retina, a qual é conduzida ao nervo ótico e enviado para o cérebro, resultando em função visual. Isso só é possível graças às proteínas que o constitui, fornecendo a transparência e o índice de refração adequados para a passagem da luz. Qualquer alteração pode causar agregação ou o enovela- mento incorreto destas proteínas e gerar deficiências, como a catarata, levando à cegueira. Este trabalho permitiu, pela primeira vez, a identificação e caracteri- zação de proteínas presentes nos cristalinos de gatos, por meio de abordagens proteômicas. Estas proteínas foram analisadas por duas estratégias: o Short Run, seguido da cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas com analisador Orbitrap (LC MS/MS), e a eletroforese bidimensional, seguida da espectrometria de massas do tipo MALDI TOF/TOF. Com o auxílio do software PEAKS, analisou-se as informações geradas pelo LC MS/MS e identificou-se 99 proteínas, das quais, 14 foram caracterizadas como as cristalinas, represen- tando 97% do total de proteínas identificadas, contra 3% do restante. O grupo beta cristalinas foi o mais representativo (52% das cristalinas), no entanto, a pro- teína alpha crystallin A chain apresentou maior abundância relativa em compa- ração com todas as demais proteínas individuais. Para a segunda estratégia, utilizou-se o software MASCOT, validado pelo SCAFFOLD, e identificou-se em diversos spots do gel SDS-PAGE 2DE, diferenças no ponto isoelétrico e na massa, indicando possíveis isoformas da alpha crystallin A chain. Analisando os dados gerados a partir do software PEAKS e pelo banco de dados do KOG, clas- sificou-se as proteínas de acordo com suas funções. Destacaram-se aquelas envolvidas no metabolismo e transporte de carboidratos, modificações pós-tra- ducional, turnover proteico, chaperonas, conversão e produção de energia, e proteínas de função geral. As duas estratégias empregadas se complementa- ram, possibilitando a obtenção do perfil proteômico do cristalino de gatos, o qual pode contribuir para um melhor entendimento das abundâncias e funções des- sas proteínas, fornecendo uma base para estudos futuros, no intuito de melhor compreender os aspectos sobre a baixa susceptibilidade do cristalino desta es- pécie animal à catarata.Item Interação cigarrinha-das-pastagens (Mahanarva spectabilis) e capim-elefante: análise proteômica dos ovos e efetores em glândulas salivares(Universidade Federal de Viçosa, 2018-02-28) Saraiva, Nayara Braga; Oliveira, Maria Goreti de Almeida; http://lattes.cnpq.br/8955261864482150A cigarrinha-das-pastagens, Mahanarva spectabilis (Distant,1909) é a principal praga em forrageiras na América Tropical. Este inseto entra em diapausa na fase de ovo durante as estações desfavoráveis do ano. Informações sobre os processos de desenvolvimento da diapausa das cigarrinhas das pastagens e a reprogramação de defesas das plantas durante a colonização do inseto são necessárias para auxiliar no desenvolvimento de táticas de seu controle. Por meio de análises proteômicas nós identificamos e caracterizamos proteínas envolvidas em ovo de M. spectabilis durante a diapausa, não-diapausa e pós-diapausa. Essas estão envolvidas no processamento de informações, sinalização celular e metabolismo dos ovos deste inseto. Na segunda etapa deste trabalho foi detectado a presença de efetores nas glândulas salivares de Mahanarva spectabilis, tais como ácidos graxos de cadeia longa e ácido salicílico que podem estar envolvidos no processo de infestação de plantas de capim- elefante. Também foi confirmado e caracterizado a presença de apirases nas glândulas salivares das M. spectabilis, evidenciando que esta enzima interfere na modulação de resistência da planta. As análises fitohormonais das folhas de capim elefante indicam uma flutuação nos níveis de hormônios em função do tempo de infestação. Estes resultados nos permitem propor que efetores presentes nas glândulas salivares de cigarrinha das pastagens são responsáveis por suprimir a resposta de defesa da planta, tornando-se uma estratégia bem sucedida do inseto na colonização do hospedeiro.Item Análise proteômica do intestino de carrapatos Amblyomma sculptum machos e fêmeas não alimentados(Universidade Federal de Viçosa, 2017-02-10) Araújo, Fernanda Sales; Siqueira, Cláudio Lísias Mafra de; http://lattes.cnpq.br/0488404328765810Os carrapatos são artrópodes parasitas que se alimentam obrigatoriamente de sangue, sendo capazes de parasitar diversos hospedeiros vertebrados. O intestino dos carrapatos machos e fêmeas possui diferenças morfológicas, tendo como principal função a digestão intracelular dos componentes do sangue obtidos durante a alimentação. Este órgão possui várias proteínas relacionadas com o desenvolvimento, metabolismo e mecanismo de digestão da hemoglobina. Neste trabalho, as proteínas do intestino de carrapatos Amblyomma sculptum, machos e fêmeas foram analisadas com o auxílio da cromatografia líquida acoplada com a espectrometria de massas. O algoritmo PEAKS identificou um maior número de proteínas do intestino nas estratégias fracionadas e não fracionadas em relação aos algoritmos MASCOT e SCAFFOLD, tanto para o banco de dados Chelicerata quanto para o banco de dados Oryctolagus, utilizando os analisadores Ion Trap e QTOF. Pelo KOG, as classes das proteínas analisadas no intestino dos carrapatos machos e fêmeas que se destacaram estão envolvidas na dinâmica e estrutura da cromatina, tradução, biogênese e estrutura ribossomal, modificação pós-traducional, turnover proteico, chaperonas, citoesqueleto, conversão e produção de energia, metabolismo e transporte de carboidratos, lipídeos e íons inorgânicos. Na identificação das proteínas do hospedeiro, a hemoglobina, componente de maior volume no sangue, foi encontrada em ambos os sexos. As informações obtidas neste trabalho podem fornecer uma base sobre a fisiologia do intestino de machos e fêmeas A. sculptum e auxiliar na escolha de proteínas como alvos moleculares potenciais, visando avanço nas estratégias de controle aplicadas para estes artrópodes.Item Análise proteômica de glândulas salivares do carrapato Amblyomma sculptum(Universidade Federal de Viçosa, 2016-06-23) Barros, Edvaldo; Siqueira, Cláudio Lísias Mafra de; http://lattes.cnpq.br/9351943615435543Os carrapatos são artrópodes hematófagos obrigatórios de grande importância médica e veterinária. Estes artrópodes tem desenvolvido adaptações evolutivas que permitem aos mesmos a sobrevivência por longos períodos de tempo sem se alimentarem ou que, após se alimentarem até a ingurgitação, vivam com a presença de altos níveis de substâncias que estimulam o estresse oxidativo. Além disso, apresentam uma anatomia bem conciliada ao seu modo de vida e aquisição de alimentos. Dentre os principais órgãos do carrapato, as glândulas salivares apresentam grande repertório de proteínas, que desempenham papéis essenciais para o seu desenvolvimento e para a manutenção de sua relação com os hospedeiros vertebrados. Essas proteínas também podem facilitar a transmissão de agentes patogênicos aos hospedeiros. Nesse projeto, o sialome do carrapato Amblyomma sculptum foi analisado utilizando cromatografia líquida acoplada com a espectrometria de massas. Essa abordagem combinada permitiu a identificação de 501 proteínas, das quais, aproximadamente, 15% foram classificadas como proteínas secretadas putativas. As classes do grupo de proteínas secretadas putativas que mais se destacaram foram: a) família das proteínas ricas em glicina; b) família das enzimas secretadas e c) ferritinas. As proteínas ricas em glicina podem desenvolver várias funções, dentre elas, a formação do cone de cemento e a resposta a estresse. Proteínas vinculadas com o citoesqueleto, com a maquinaria de modificação proteica e com o transporte intracelular também foram identificadas, as quais foram reunidas no grupo “putative housekeeping proteins”. A diferença na abundância das proteínas entre os gêneros macho e fêmea, encontradas nas glândulas salivares dos carrapatos A. sculptum, foi indicada pela identificação de proteínas em apenas um dos sexos. As proteínas ricas em glicina, do citoesqueleto e chaperonas foram identificadas em maior número em machos do que em fêmeas, sugerindo que esse gênero esteja melhor preparado para a produção de cemento, resposta ao estresse, modificação proteica e transporte intracelular do que as fêmeas. A caracterização funcional das proteínas permitiu uma correlação dentro de um contexto biológico e facilitou um melhor entendimento sobre o sialome de carrapatos A. sculptum. Essa informação pode auxiliar na identificação de novos candidatos a alvos para o controle de carrapatos, no entanto, estudos adicionais devem ser realizados com o objetivo de melhorar o conhecimento das vias de controle das diferentes funções celulares.Item Caracterização de estirpes de Staphylococcus aureus e dispersão de biofilmes por uma lectina tipo C de Bothrops jararacussu(Universidade Federal de Viçosa, 2016-07-29) Aguilar, Ananda Pereira; Ribon, Andréa de Oliveira Barros; http://lattes.cnpq.br/8173710952837463A grande diversidade de estirpes de Staphylococcus aureus em circulação nos rebanhos leiteiros reforça a necessidade de uma melhor caracterização dessas bactérias a fim de gerar informações que possam ser usadas no controle da mastite bovina. Neste trabalho, hipotetizou-se que estirpes de S. aureus geneticamente relacionadas causam diferentes formas de mastite. As bactérias S. aureus 302 e S. aureus 322, foram isoladas de vacas com mastite persistente e não-persistente, respectivamente, e apresentaram os mesmos genes de virulência e perfis de bandas idênticos quando genotipadas por análise em multilocus de repetições em tandem de número variável (MLVA). Por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE), utilizado como um método genotípico adicional, comprovou-se que as bactérias são geneticamente relacionadas. Apesar dessa proximidade, ensaios in vitro de produção de biofilme, hemólise, invasão e persistência em células mamárias bovinas MAC-T e virulência in vivo em modelo Galleria mellonella comprovaram diferenças significativas entre as estirpes. Os resultados sugerem que apenas a caracterização molecular é insuficiente para correlacionar sintomas da doença à uma determinada estirpe. S. aureus 302 e S. aureus 322, além de S. aureus 469 (mastite persistente) e S. aureus 366 (mastite não-persistente) foram contrastadas por uma abordagem proteômica. Extratos de proteínas totais foram preparados a partir de bactérias crescidas até a fase exponencial e separados por eletroforese bidimensional. Um total de 35 spots com abundância diferencial foi detectado, dos quais três foram exclusivos de S. aureus 302 quando comparada a S. aureus 322 e S. aureus 366 e podem representar marcadores que indicam a persistência da bactéria no animal. Este trabalho também avaliou a dispersão de biofilmes de S. aureus NRS 155 e S. epidermidis NRS 101 pela lectina BjcuL, isolada de Bothrops jararacussu. Essa lectina não impediu a adesão inicial das células e foi capaz de inibir a formação de biofilmes quando pré-aderida a superfícies abióticas. Houve uma melhor atividade sobre biofilme pré-formado de S. aureus NRS 155 em comparação S. epidermidis NRS 101. Por qRT-PCR, detectou-se uma alteração na expressão de genes envolvidos no controle do operon ica, responsável pela produção do polissacarídeo de adesão intercelular. Finalmente, BjcuL foi capaz de restaurar a susceptibilidade de bactérias em biofilme pré-formado a antibióticos como gentamicina e ampicilina, revelando o potencial da estratégia antibiofilme no controle de infecções de S. aureus.Item Análise proteômica e metabolômica de soja: aspectos moleculares da tolerância a seca em plantas transgênicas expressando BiP(Universidade Federal de Viçosa, 2016-02-04) Coutinho, Flaviane Silva; Ramos, Humberto Josué de Oliveira; http://lattes.cnpq.br/5823859828589031Dentre os fatores ambientais, a seca é uma das principais causas na limitação da produção agrícola. Alguns fatores, como indicadores de expansão da área de plantio e alterações climáticas, evidenciam a necessidade de desenvolvimento de genótipos mais tolerantes. Nosso grupo de pesquisa na Universidade Federal de Viçosa (UFV) tem observado que a chaperona molecular BiP atua em respostas a estresses no retículo endoplasmático (ER) e osmótico, conferindo uma maior tolerância à seca. Neste trabalho, foram caracterizados os perfis proteômicos e metabólicos de plantas transgênicas de soja superexpressando a chaperona molecular BiP e de sua isolinha por eletroforese 2DE-MS e GC/MS, respectivamente. E análise de hormônios utilizando LC-MS. Plantas transgênicas apresentaram uma maior abundância relativa de proteínas relacionadas à fotossíntese, o que sustenta a hipótese que estas plantas estão predispostas geneticamente e fisiologicamente a suportar períodos de seca. Ao contrário do genótipo selvagem, plantas transgênicas não apresentaram mudanças significativas em proteínas relacionadas à glicólise, respiração e estresse oxidativo, o que evidencia uma menor percepção do estresse pelo genótipo geneticamente modificado. O acúmulo intracelular de solutos osmoticamente ativos pode ser um importante mecanismo de ajuste adotado pelas plantas transgênicas. Como evidenciado pelos perfis metabólicos, o acúmulo de aminoácidos pode ser o mecanismo responsável pela manutenção da turgescência celular no genótipo transgênico. Este mecanismo protetor pode possibilitar que a fotossíntese e outras atividades fisiológicas sejam mais operantes em condições de seca. Em condições de déficit hídrico, o ácido salicílico parece ter considerável importância em induzir efeitos de proteção na planta transgênica, podendo ter uma possível ação antagonista ao ácido jasmônico.