Bioquímica Aplicada
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Item Produção, purificação e caracterização parcial da dextranase de Pochonia chlamydosporia (VC4) e sua aplicação na remoção de dextrana do caldo de cana(Universidade Federal de Viçosa, 2016-02-17) Sufiate, Bruna Leite; Queiróz, José Humberto de; http://lattes.cnpq.br/2650132859878837Dextranases (EC 3.2.1) são enzimas que hidrolisam ligações α-(1,6), α-(1,2), α-(1,3) e α-(1,4) em polissacarídeos de dextrana, sendo produzidas por fungos, bactérias e algumas leveduras. São utilizadas na produção de dextrana para aplicações clínicas, na produção de isomaltooligossacarídeos e oligodextranas prebióticos, em produtos de higiene bucal para o tratamento e a prevenção de cáries e para remoção de dextranas na indústria de açúcar. O objetivo deste trabalho foi produzir, purificar e caracterizar parcialmente a dextranase produzida pelo fungo Pochonia chlamydosporia (VC4) e avaliar sua aplicação na remoção de dextranas em caldo de cana. Os efeitos de diferentes componentes do meio de cultura na produção de dextrana foram analisados através do delineamento de Plackett-Burman e do delineamento composto central. A superfície de resposta foi utilizada para determinar quais os níveis, dentre as variáveis que influenciam a produção de dextranase, proporcionam maior produção desta enzima pelo fungo P. chlamydosporia. Avaliou-se, ainda, a aplicação da dextranase na remoção de dextrana do caldo de cana. O extrato bruto foi parcialmente purificado em resina de troca iônica DEAE-Sepharose. A atividade de dextranase foi avaliada em diferentes pHs, temperaturas e na presença de íons metálicos. Apenas dois componentes do meio de cultura, NaNO 3 e pH, demonstraram efeito significativo (p<0,05) sobre a produção de dextranase. Os níveis de NaNO 3 e pH que proporcionaram maior produção desta enzima foram, respectivamente, 5 g/L e 5,5. A dextranase de P. chlamydosporia mostrou-se eficaz em remover a dextrana presente no caldo de cana, reduzindo em 75% o teor de dextrana após 12 horas, quando comparado com o controle. O rendimento da purificação foi 128%, o fator de purificação foi 2,58, e a atividade específica de 114,66 U/mg. A temperatura e a faixa de pH que resultaram em maior atividade foram, respectivamente, 50 °C, e 5,0 a 6,0. O íon Cu 2+ inibiu a atividade da dextranase em 55%, e o íon Mg 2+ aumentou a atividade em 24%, em relação ao controle.Item Enzimas vegetais e fúngicas com potencial nematicida(Universidade Federal de Viçosa, 2018-03-02) Sufiate, Bruna Leite; Queiroz, José Humberto de; http://lattes.cnpq.br/2650132859878837Fungos e plantas produzem enzimas que possuem as mais diversas aplicações biotecnológicas. Uma possível e promissora aplicação dessas enzimas é o controle de nematoides, em substituição aos nematicidas químicos prejudiciais à saúde humana e animal, ao meio ambiente e à microbiota do solo. Outra possível aplicação das enzimas de fungos é o uso da dextranase na redução de dextrana na indústria sucroalcooleira. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo investigar a produção de enzimas pelo fungo Pleurotus eryngii e pelas plantas Euphorbia milii e E. trigona, purificar e caracterizar as enzimas de E. milii, E. trigona e Pochonia chlamydosporia, e testar a atividade nematicida das enzimas das plantas E. milii, E. trigona e do fungo P. eryngii. O fungo P. eryngii e seu extrato reduziram significativamente (p<0,01) o número de larvas intactas de Panagrellus sp. após 24 horas de tratamento em 60 e 90%, respectivamente. Este efeito não está relacionado à atividade enzimática, mas sim à presença de outros metabólitos. Os ovos de Meloidogyne javanica, quando tratados com o extrato de P. eryngii, mostraram redução de 53% (p<0,01) no número de ovos intactos. A redução de ovos intactos de M. javanica é atribuída à atividade enzimática, uma vez que o extrato apresentou atividade quitinolítica e proteolítica de, respectivamente, 32,74 e 3,57 U/mL. A purificação do látex de E. trigona por cromatografia de exclusão molecular permitiu a purificação de três proteases distintas. O peso molecular das proteases foi estimado em aproximadamente: 36, 31 e 29 kDa, para a trigonina 1, 2 e 3, respectivamente. O pH e a temperatura que proporcionaram maior atividade de protease foram 4,0, 6,0 e 9,0, e temperatura de 70 °C. As proteases foram inibidas por fluoreto de fenilmetilsulfonila e iodoacetamida. O pool das três proteases presentes no látex de E. trigona reduziram significativamente (p<0,01) o número de J 2 vivas de M. incognita em 96% após 24 horas de tratamento. A purificação parcial das proteases presentes no látex de E. milii indicou que estas proteases correspondem à milina e miliina. Estas enzimas reduziram em 65,59% e 96,46% o número de larvas de Panagrellus redivivus após 24 e 48 h, respectivamente (p<0,01). A dextranase produzida pelo fungo P. chlamydosporia foi purificada à homogeneidade em duas etapas, com rendimento de 152%, fator de purificação de 6,84 e atividade específica de 358,63 U/mg. Seu peso molecular foi estimado por SDS-PAGE em 64 kDa. A enzima apresentou maior atividade a 50 °C e pH 5,0, usando tampão citrato-fosfato 100 mM, foi inibida por Ag 1+ , Hg 2+ , Cu 2+ , Mg 2+ , e apresentou K M de 1,77 g/L. A dextranase madura é composta por 585 resíduos de aminoácidos, com peso molecular predito de 64,38 kDa e pI 5,96. Esta dextranase demonstrou forte semelhança filogenética em comparação à dextranase de Trichoderma harzianum. Sua estrutura consiste de dois domínios: o primeiro composto por 15 cadeias beta, e o segundo composto por uma β-hélice paralela. Esses resultados evidenciam o potencial biotecnológico desses fungos, plantas e suas enzimas extracelulares informações acerca no da controle dextranase de nematoides, produzida pelo e fornecem fungo P. chlamydosporia, que podem ser utilizadas para futuras aplicações industriais desta enzima.