Bioquímica Aplicada
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Item Modelagem molecular e cinética enzimática: análises da inibição de tripsinas de pragas Lepidoptera por proteínas envolvidas na defesa de plantas(Universidade Federal de Viçosa, 2019-11-13) Meriño Cabrera, Yaremis Beatriz; Oliveira, Maria Goreti de Almeida; http://lattes.cnpq.br/0721416696417941Inibidores de proteases (IPs) são considerados uma alternativa mais sustentável aos pesticidas inorgânicos comumente utilizados no controle de pragas. A atuação de IPs nas tripsinas digestivas de herbívoros gera impactos negativos em parâmetros do ciclo de vida destes, como sobrevivência, peso larval e oviposição. Embora existam IPs naturais com atividade inseticida satisfatória, muitos destes são superados pelos insetos através da expressão de novas proteases. Além disso, inibidores de tripsinas naturais são moléculas grandes, aumentando as chances de serem clivados e inativados por outras enzimas proteolíticas. Sendo assim, o desenvolvimento de inibidores de proteases orgânicos de pequenas cadeias de resíduos de aminoácidos e alta especificidade a tripsinas do intestino médio de herbívoros, pode auxiliar no controle de pragas agrícolas. Assim, neste estudo foi testado a capacidade de inibição de duas proteínas inhibitorias, ApTI (do inglês Adananthera pavonina trypsin inhibitor) e ILTI (do inglês Inga laurina trypsin inhibitor), sobre tripsinas das espécies Spodoptera cosmioides e Anticarsia gemmatalis, ambas as espécies pertencem à ordem Lepidoptera. O sítio de ligação e o potencial de inibir tripsina-like destas especies pelos inibidores foram avaliados por docking e dinâmica molecular, ensaios para caracterização de parâmetros cinéticos e ensaios biológicos, misturando os inibidores em dieta artificial. O objetivo foi analisar o potencial inibiotório destas proteínas e a partir dos resultados estruturais e bioquímicos obtidos, desenvolver peptídeos com alta capacidade inseticida, que possam ser utilizados como modelo para a produção de peptídeos miméticos, serem pulverizados nas plantas, ou gerar dados para o desenvolvimento de plantas transgênicas. Os inibidores ILTI e ApTI apresentam alto potencial biotecnológico como agentes contra insetos fitófagos Lepidoptera, inibindo tripsinas por inibição tight-binding, com características competitivas e não competitivas, respectivamente. A ação de ApTI e ILTI no desenvolvimento de larvas de S. cosmioides e A. gemmatalis mostra que estes inibidores influenciam a sobrevivência larval, indicando seu potencial tóxico. Os peptídeos derivados do sitio reativo do inibidor ILTI apresentam afinidade pelas enzimas tripsinas de S. cosmioides e reduzem sua atividade biológica, confirmando o potencial inibitório destes compostos. Palavras-chave: Proteínas-inibidores. Simulação de acoplamento molecular. Insetos. Peptídeos. Enzimas proteolíticas.Item Resposta de plantas de Coffea arabica (Rubiaceae) às injúrias de Leucoptera coffeella (Lepidoptera: Lyonetiidae) através das vias das lipoxigenases e atividade de polifenoloxidases(Universidade Federal de Viçosa, 2015-07-24) Meriño Cabrera, Yaremis Beatriz; Oliveira, Maria Goreti de AlmeidaA defesa das plantas contra os insetos são processos complexos que envolvem a ativação ou repressão de diferentes vias de sinalização, permitindo assim a sobre- expressão de genes alvo com propriedades de defesa. O objetivo deste estudo foi determinar a relação entre a resposta defensiva de Coffea arabica mediante as vias das lipoxigenases e polifenoloxidases e o processo de herbivoria de Leucoptera coffeella. Foi realizado um experimento com dois tratamentos: 1) plantas de café infestadas e 2) plantas não infestadas com bicho–mineiro. Cada tratamento foi composto por 10 repetições e avaliou-se a atividade das lipoxigenases e polifenoloxidases; e a produção de inibidores de proteases no cafeeiro. Em L. coffeella a atividade de tripsina-like foi verificada usando os substratos L-BApNA e L-TAME e a quimotripsina-like foi determinada com BTpNA e ATEE. As cisteíno-proteases deste inseto foi obtida utilizando L-BApNA e proteases totais usando azocaseína como substrato. Todas as atividades enzimáticas foram determinadas por espectrofotometria. Houve um aumento nas atividades enzimáticas das plantas infestadas em relação as não infestadas nas vias estudas (lipoxigenase: F= 29,4; p= 0,00022 e polifenoloxidases: F= 8,41; p= 0,00022) e na produção de inibidores de proteases (F= 9,64; p= 0,0022). A partir das análises de correlação de Pearson, observou-se que a quimotripsina-like e os inibidores de proteases apresentaram uma relação inversa (r= -0,82; p= 0,03). Já a tripsina-like teve correlação direta com as atividades das lipoxigenases (r= 0,6; p= 0,03) e polifenoloxidases (r= 0,82; p= 0,03). Diante do exposto, nas larvas de L. coffeella existe atividade tanto serino como cisteíno-proteases, mas a atividade serino-proteases é a mais expressada no intestino destes insetos. A produção de inibidores de proteases e as atividades de lipoxigenases e polifenoloxidases nas plantas de C. arabica são aumentadas na presença de L. coffeella, o que indica a possível participação destas vias no processo de defesa da planta. Palavras chaves: inibidores, tripsina, bicho-mineiro.