Bioquímica Aplicada
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Item Comunicação cruzada entre imunidade antiviral, antibacteriana e eventos de desenvolvimento mediados pelos receptores NIK1, NIK2 e NIK3(Universidade Federal de Viçosa, 2021-01-28) Ferreira, Marco Aurélio; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/1816104875180710As proteínas NIKs (NSP- INTERACTING KINASE), são LRR-LRKs (leucine-rich repeat receptor-like kinase) que se localizam na membrana plasmática e foram identificadas inicialmente por interagirem com a proteína NSP (NUCLEAR SHUTTLE PROTEIN) de geminivírus. NIK1 pertence à subfamília II de LRR-RLKs, cujos membros contém cinco repetições de leucina no domínio extracelular, e forma um sub-grupo contendo NIK1, NIK2 e NIK3. NIK1 e NIK2 divergem quanto a funcionalidade e estrutura de NIK3, sendo NIK1 a mais bem caracterizada, atuando na imunidade antiviral. Recentemente, foi demonstrado por meio de análises cêntricas da rede de interações entre receptores LRR de membranas que NIK1 e NIK3 formam “hubs” com alto grau de centralidade e, portanto, presume-se que sejam altamente influentes como transmissores de informação nas células. Estas observações levantaram as hipóteses de que NIK1 e NIK3 pudessem estar envolvidos em diversas vias de sinalização celular. Assim sendo, o objetivo dessa investigação foi caracterizar o envolvimento de NIK1, NIK2 e NIK3 em vias de sinalização de defesa e desenvolvimento. Nós relatamos primeiro que NIK1, anteriormente mostrado como um regulador positivo da imunidade antiviral de plantas, atua como um regulador negativo da imunidade antibacteriana. NIK2 também demonstrou funcionar como um supressor de imunidade desencadeada por PAMP (PTI). Embora a inativação de NIK2 não tenha afetado à infecção por Pseudomonas syringae pv. tomate (Pst) DC3000 e P. Syringae pv. maculicola (Psm) ES4326, o mutante nik2-1 mostrou ser mais suscetível ao crescimento de Pst DC3000 hrcC, o mutante de secreção não patogênico Pst DC3000 tipo III, demonstrando a modulação negativa de PTI por NIK2. A modulação negativa de PTI mediada por NIK1 foi mais forte do que NIK2. As plantas que são nik1 nulo exibiram morfologia anã, maior resistência a doenças causadas pela bactéria Pseudomonas Syringae e respostas PTI aumentadas por flagelina bacteriana, que foram restaurados pela reintrodução de NIK1. De forma consistente, as linhagens de superexpressão de NIK1 exibiram um fenótipo oposto. Além disso, NIK1 regulou negativamente a formação do complexo FLS2 / BAK1 e respostas mediadas por flg22. As interações entre NIK1 e o receptor de flagelina FLS2 e o co-receptor BAK1 foram aumentadas após a percepção de flg22, revelando um novomecanismo regulador de PTI por um RLK. Além disso, a percepção de flg22 induziu a fosforilação de NIK1 e RLP10A in vivo e, por sua vez, ativou o ramo de controle de tradução a jusante da sinalização antiviral. O mecanismo subjacente proposto para a modulação inversa mediada por NIK1 da imunidade antiviral e antibacteriana pode permitir que bactérias e vírus ativem respostas imunes do hospedeiro uns contra os outros. Em relação ao NIK3, propusemos pesquisar seu envolvimento na defesa e no desenvolvimento examinando primeiro o transcriptoma induzido por NIK3. Também examinamos o efeito do tratamento com brassinosteróides na variação global da expressão gênica em linhas de superexpressão de NIK3. Os resultados dessas análises genômica funcional confirmaram que NIK3 pode estar envolvido na defesa e no desenvolvimento. NIK3 pode estar envolvido na sinalização de citocinina (CK) em vez da sinalização de BR. Em comparação com Col-0, BR induziu respostas semelhantes em linhagens de superexpressão de NIK3. No entanto, a superexpressão de NIK3 regulou negativamente nove genes envolvidos na percepção e homeostase de CK, incluindo dois receptores de CK, AHK4 e AHK5, duas proteínas de fosfotransferência de histidina (AHPs), AHP1 e AHP5, reguladores positivos da sinalização de CK que fosforilam as ARRs do tipo B (Regulador de resposta de Arabidopsis). ARR4 e ARR8 retransmitem o sinal de CK do citoplasma para o núcleo para induzir a expressão de genes. Como um regulador negativo da sinalização de CK ARR15, um ARR tipo B, foi induzido por NIK3. Os transportadores de purinas e derivados PUP1, PUP2 e PUP14 foram regulados negativamente por NIK3. O PUP14 é um regulador negativo da detecção de CK, pois transporta a CK do apoplasto para o citosol; assim, impedindo AHKs de detectar CK e iniciar a sinalização. Portanto, a superexpressão de NIK3 revelou a regulação de uma série de genes associados à sinalização de CK. Especificamente, os principais reguladores da percepção e sinalização de CK foram reprimidos pela superexpressão de NIK3, sugerindo que NIK3 pode controlar negativamente a sinalização de CK. A superexpressão do NIK3 também regulou negativamente os genes associados às respostas imunológicas. Estes incluem os PRR-RLKs, FLS2 e EFR, que reconhecem os PAMPs bacterianos fls2 e EF-Tu para iniciar PTI, MAPK e fatores de transcrição WRKYs, envolvidos nas respostas imunes. Da mesma forma, NIK3 regulou negativamente os genes R, RRS1 e RPM1, bem como FRK1, um modulador das respostas imunes. Apesar da regulação negativa dos genes de defesa mediada por NIK3, PTI não foi aparentemente afetado, uma vez que a infecção por Pst DC3000 e o crescimento em linhagens superexpressando NIK3 foram semelhantes a Col-0. Portanto, é razoável supor que NIK3 regule principalmente ETI. Coletivamente, esses resultados sugerem que NIK3 é predominantemente um reguladornegativo da sinalização e desenvolvimento, como na sinalização de CK, e da resposta imune, do tipo ETI. Palavras-chave: Imunidade antiviral. Imunidade antibacteriana. Desenvolvimento. RNA-seqItem NIK1 (Nuclear shuttle protein-interacting kinase), um novo componente da via de resposta a brassinosteróides(Universidade Federal de Viçosa, 2016-07-27) Ferreira, Marco Aurélio; Fontes, Elizabeth Pacheco Batista; http://lattes.cnpq.br/1816104875180710O receptor LRR-RLK (Leucine-rich repeat receptor-like kinase), designado NIK1 (NSP-interacting kinases), está envolvido na resposta imunológica em plantas contra Germinivirus. NIK1 foi inicialmente descrito por interagir com a proteína viral NSP (nuclear shuttle protein), proteína que participa do transporte de DNA viral do núcleo para o citoplasma de células infectadas. Com alta similaridade estrutural a NIK1, BAK1 (Brassinosteroid Insensitive Associated Kinase1), também conhecida como SERK3 (Somatic Embryogenesis Receptor Kinase3), é um receptor LRR-RLK de membrana que desempenha um duplo papel em vias de sinalização, podendo atuar como um coreceptor de BRI1 na presença de BR ou mediar respostas de defesa contra patógenos. Na via de crescimento desencadeada por brassinosteróides (BRs), BAK1 interage com BRI1 (Brassinosteroid-insensitive1) na membrana plasmática e ativa a função de cinase desta proteína. Recentemente, através de dados de RNA-seq, foi demonstrado que inativação da função de NIK1 no nocaute nik1 (Salk_060808) induz a expressão de genes envolvidos na resposta a BRs e desenvolvimento, indicando uma possível comunicação cruzada entre a via de sinalização antiviral mediada por NIK1 e vias de sinalização de desenvolvimento. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo avaliar o papel de NIK1 na via de resposta a BRs. Arabidopissis thaliana, linhagem nik1 nocaute, foi transformada com as construções de DNA 35S:BAK-NIK1_GFP e 35S:NIK1-BAK1_GFP, sendo que a expressão dos transgenes e localização subcelular na membrana das proteínas quiméricas foram confirmadas por RT-PCR e microscopia confocal, respectivamente. Análises fenotípicas de plantas expressando as construções quiméricas BAK1-NIK1 e NIK1-BAK1 indicaram deficiência na via de desenvolvimento induzido por BR, uma vez que o fenótipo destas plantas transgênicas se assemelharam muito ao mutante bak1-4, deficiente na sinalização por BR. Além disso, a ativação da via de sinalização por BRs foi avaliada por meio de crescimento de hipocótilo e de análise da expressão de genes marcadores induzidos por brassinolídeo (BL). Em nik1, o tratamento com BL estimulou o crescimento do hipocótilo e induziu genes marcadores associados à sinalização por BR, embora em menor intensidade do que em Col-0, indicando funcionamento da via de desenvolvimento induzida por BR nesta linhagem nocaute. Expressão de ambas as proteínas quiméricas em nik1 mutante, que expressa os genes BAK1 e BRI1 normalmente, restaurou o fenótipo insensível a BL, típico do nocaute bak1-4. Claramente, a expressão dos genes quiméricos interferiu negativamente com a via de sinalização de BR, uma vez que nas linhagens transgênicas, BL não estimulou o alongamento do hipocótilo e tampouco a indução da expressão de genes marcadores associados à via de sinalização de BR. Estes resultados indicam que as proteínas quiméricas atuam como alelos mutantes transdominantes negativos na sinalização por BR. Esta hipótese foi fundamentada pela capacidade de NIK1 de interagir com BAK1, conforme previamente demonstrado, e com o domínio cinase de BRI1, demonstrado nesta investigação por meio de duplo híbrido em leveduras. Embora não se tenha observado uma ativação aumentada da resposta a BR no nocaute nik1, provavelmente devido a redundância funcional da subfamília NIK, os fenótipos resultantes da expressão das proteínas quiméricas, contendo ou o domínio LRR ou o domínio de cinase de NIK1, sugerem que NIK1 atue como um regulador negativo da sinalização por BR.