Microbiologia Agrícola
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Item Diversidade fúngica em solos sob pastagens e floresta da Bacia Amazônica e potencial desses fungos para o controle de fitoptógenos(Universidade Federal de Viçosa, 2016-07-15) Cerqueira, Alan Emanuel Silva; Silva, Cynthia Canêdo da; http://lattes.cnpq.br/7635148171647668A floresta amazônica, considerada um dos locais de maior biodiversidade do planeta, tem sido submetida a elevadas taxas de desflorestamento. Em Rondônia, cerca de 36% do total da área florestal do Estado já foi desmatada, devido, principalmente, às atividades de pastagem. Considerando que ainda pouco se conhece os efeitos que esta conversão pode causar na microbiota do solo, no equilíbrio e na resiliência do ecossistema, estudos vêm sendo realizados para sua melhor compreensão. Entretanto, o maior enfoque tem sido sobre as bactérias, ao passo que os fungos têm sido menos explorados. Em adição, os estudos realizados com fungos não utilizaram, em sua maioria, técnicas de sequenciamento de nova geração. Portanto, a aplicação destas técnicas pode contribuir para o melhor entendimento dos efeitos da alteração do ambiente na composição e diversidade de fungos do solo. Os danos ambientais causados pela utilização de defensivos agrícolas têm estimulado a adoção de práticas ambientalmente corretas, dentre elas, a aplicação de microrganismos e seus metabólitos para o controle biológico de fitopatógenos. Com o avanço da pecuária sobre as áreas das bacias hidrográficas do Rio Mutum-Paraná-RO, está ocorrendo uma conversão da Floresta Ombrófila Aberta em áreas de pastagem. Desse modo, o isolamento de fungos do solo desta região pode favorecer a obtenção de microrganismos aptos a atuarem no biocontrole, antes que estes sejam perdidos por este processo. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo, numa perspectiva ecológica, avaliar de que modo a conversão de floresta em pastagem, na região da Bacia do Rio Mutum-Paraná-RO, altera o perfil funcional, a composição e a diversidade das comunidades fúngicas do solo. Em adição, numa perspectiva biotecnológica, se objetivou obter isolados fúngicos originários de regiões de pastagem e floresta e, testá-los quanto à sua eficiência no controle dos fitopatógenos, Fusarium oxysporum f. sp. cubense causador do mal-do-Panamá na cultura da banana e, Botrytis cinerea e Colletotrichum acutatum causadores do mofo cinzento e, antracnose, na cultura do Morango, respectivamente. Os resultados encontrados não revelaram nítidas diferenças funcionais entre os ambientes. Entretanto, houve uma alteração na composição taxonômica dos fungos com destaque para presença de Glomeromycota apenas na pastagem e ocorrência de Zygomycota praticamente apenas na floresta. O filo Ascomycota foi o mais abundante e Basidiomycota teve baixa incidência em ambos ambientes. Foi observado aumento na diversidade alfa de fungos na pastagem acompanhada por uma homogeneização biótica, neste ambiente. Em relação ao isolamento de fungos, foram obtidos 74 isolados, dos quais cerca de 23 (31%) apresentaram potencial antagônico in vitro a pelo menos um dos fitopatógenos.Item Análise do crescimento e produtos do metabolismo aeróbio e anaeróbio de isolados clínicos de Actinobacillus pleuropneumoniae sorotipo 8(Universidade Federal de Viçosa, 2016-05-30) Souza, Juliana Ângelo de; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://lattes.cnpq.br/6372735918840993Actinobacillus pleuropneumoniae é o agente etiológico da pleuropneumonia suína, uma doença respiratória que afeta suínos de todas as idades no mundo. Atualmente são descritos 16 sorotipos da bactéria com virulência distinta. Esta virulência de A. pleuropneumoniae é multifatorial, e inclui as toxinas RTX, cápsula, produção de biofilme, LPS e proteases. O metabolismo central possui papel importante na virulência bacteriana, uma vez que a adaptação da bactéria à disponibilidade de nutrientes é essencial para a sobrevivência e colonização no hospedeiro. Os isolados clínicos de A. pleuropneumoniae sorotipo 8, 1022 e 780, considerados os de maior e menor virulência em estudo realizado em Galleria mellonella foram utilizados neste trabalho, assim como a linhagem referência do sorotipo 8. Na tentativa de explicar a razão da diferença de virulência apresentada pelos isolados foram feitas curvas de crescimento em caldo BHI, caldo BHI acrescido de glicose e caldo BHI acrescido de galactose, em condições de aerobiose e anaerobiose. A determinação da velocidade específica de crescimento e a análise da produção de ácidos orgânicos, de cada um dos isolados, também foi realizada, tanto em aerobiose quanto em anaerobiose. Os resultados mostraram que o isolado 1022 apresentou maior velocidade específica de crescimento em relação ao isolado 780 e à linhagem referência em todas as condições investigadas. O perfil de ácidos orgânicos produzidos foram distintos em aerobiose e em anaerobiose, sendo o ácido acético o de maior produção em aerobiose e o ácido láctico maior produção em anaerobiose. Portanto, foi possível verificar que o isolado 1022 apresentou maior produção de ácido láctico em anaerobiose em relação ao isolado 780 e à linhagem referência. A velocidade de crescimento e a produção de ácido láctico mostraram-se diferenciadas no isolado 1022 indicando que a maior virulência, apresentada por esse isolado no ensaio de infecção, pode estar diretamente relacionada ao seu metabolismo.Item Efeito de nisina sobre a atividade proteolítica de Serratia liquefaciens(Universidade Federal de Viçosa, 2016-09-16) Felipe, Fábio de Oliveira; Vanetti, Maria Cristina Dantas; http://lattes.cnpq.br/5872764934243592A desestabilização, a diminuição do rendimento, da qualidade sensorial e da vida útil de produtos lácteos processados durante a estocagem são problemas associados principalmente, à atividade de proteases resistentes a altas temperaturas, muitas dessas de origem bacteriana. Em busca do aumento do tempo de prateleira dos produtos alimentares, antimicrobianos naturais, como as bacteriocinas, são uma importante alternativa. Nisina é uma bacteriocina geralmente reconhecida como segura (GRAS) e de reconhecida efetividade para inibir o crescimento de bactérias envolvidas em doenças de origem alimentar e bactérias deterioradoras de alimentos. No intuito de ampliar o uso de nisina, objetivou-se avaliar o seu efeito sobre a atividade proteolítica de isolados de Serratia liquefaciens, uma das bactérias prevalentes em amostras de leite cru. Esta bactéria produz dois tipos de metaloproteases, Serl, termossensível e Ser2, termorresistente. Inicialmente, foi avaliada a influência dos meios de cultura sobre a atividade proteolítica total de dois isolados de S. liquefaciens e, na presença de cálcio, a atividade proteolítica foi aumentada. Na avaliação da atividade proteolítica total e de Ser2 de S. liquefaciens em duas temperaturas, em que 17 isolados foram avaliados, apenas cinco foram proteolíticos a 7 °C, enquanto 12 o foram a 30 °C. Esta diferença pode ser atribuída ao tempo de incubação nas temperaturas avaliadas. Os isolados L53, L95 e L98 foram selecionados para a comparação da atividade proteolítica de Serl e Ser2 e, principalmente, para avaliação do efeito de nisina sobre a atividade proteolítica de S. liquefaciens. Constatou-se que a proteólise detectada ao final da fase exponencial de crescimento é causada, essencialmente, por Ser2, enquanto a atividade de Serl é maior na fase estacionária. Nisina não afetou o crescimento dos isolados de S. liquefaciens L53, L95 e L98, sob temperatura ótima, enquanto que, sob refrigeração, houve redução no crescimento dos isolados L53 e L95. A 7 °C e a 30 °C, a presença de nisina reduziu, significativamente, a atividade proteolítica de S. liquefaciens, sendo mais eficiente na redução da proteólise causada por Ser2. A redução da atividade proteolítica de Ser2 de S. liquefaciens na presença de nisina sugere que o uso de bacteriocinas pode ser uma estratégia a ser explorada para a melhoria da qualidade de leite e dos produtos lácteos, considerando que proteases termorresistentes representam grande problema na indústria do leite.Item Identificação, caracterização e análise de expressão de genes que codificam peptidil sintases não-ribossomais em Colletotrichum lindemuthianum(Universidade Federal de Viçosa, 2016-02-23) Correia, Hilberty Lucas Nunes; Queiroz, Marisa Vieira de; http://lattes.cnpq.br/5718975445923498Os fungos em geral, são grandes produtores de metabólitos secundários, que são compostos com funções e estruturas altamente diversas, não requeridos para o crescimento. Dentre os metabólitos secundários destaca-se a classe dos peptídeos não- ribossomais (NRPs), que são polímeros de aminoácidos proteinogênicos e não- proteinogênicos, hidroxiácidos e ácidos carboxílicos. Esta classe de metabólitos é sintetizada pelo mecanismo de auto-molde pela atividade de grandes complexos enzimáticos multidomínios e multimodulares, denominados peptidil sintetases não- ribossomais (NRPSs). Entre as funções de peptídeos não-ribossomais já relatadas estão: imunossupressão, papel de toxinas envolvidas na patogênese, quelação de ferro e etc. O presente trabalho teve como objetivo realizar a identificação e caracterização das NRPSs em Colletotrichum spp. Além disso, foi realizada a análise da expressão dos genes que codificam NRPSs em Colletotrichum lindemuthianum, agente etiológico da antracnose do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.). Foram identificados os genes que codificam NRPSs nos genomas de C. lindemuthianum (isolados 83, 89 e 7R), Colletotrichum fioriniae, C. glosporioides C. graminicola, C. higginsianum e C. orbiculare. O número de genes que codificam NRPSs identificadas variou para cada genoma em questão de 6 a 22. Todos os genes que codificam NRPSs foram encontrados como parte de agrupamentos contendo genes que codificam outras enzimas biossintéticas. A análise filogenética utilizando sequências dos domínios A indicou uma grande diversidade de NRPSs em Colletotrichum spp., sendo que algumas destas são ortólogas de proteínas responsáveis pela síntese de produtos relacionados à virulência de fitopatógenos como NPS6 e Hts1. Em C. lindemuthianum foram encontradas nove NRPSs, sendo duas destas ortólogas de Hts1 e NPS6. Apenas uma das NRPSs aqui identificadas é específica para a espécie C. lindemuthianum. A análise dos transcritos de C. lindemuthianum nas diferentes fases de desenvolvimento em plantas de feijoeiro e in vitro revelou que todos estes genes são expressos em ao menos uma das fases de desenvolvimento do fungo.Item Caracterização de microrganismos e sucessão da comunidade microbiana em silagem de cana-de-açúcar(Universidade Federal de Viçosa, 2016-02-23) Oliveira, Wemerson de Castro; Mantovani, Hilário Cuquetto; http://lattes.cnpq.br/4906043209502220Em países de clima tropical, a silagem de cana-de-açúcar tem sido preconizada para uso na alimentação de ruminantes. No entanto, a cana-de-açúcar ensilada pode ter a qualidade diminuída devido à presença de microrganismos indesejáveis, como as leveduras. O interesse em compreender a dinâmica da sucessão microbiana durante a fermentação da cana-de-açúcar está relacionado com as perdas nutricionais associadas com a fermentação alcoólica causada pelas leveduras. Neste estudo, foram isoladas e caracterizadas 99 culturas de leveduras e 164 culturas de bactérias obtidas da cana in natura e da silagem de cana-de-açúcar obtidas em diferentes tempos de fermentação (1, 3, 7, 14, 21 e 28 dias). Além disso, a análise da composição da comunidade bacteriana e fúngica da silagem de cana-de açúcar foi realizada utilizando a técnica de PCR-DGGE. Foram identificadas dez espécies de leveduras pertencentes aos gêneros Candida, Pichia, Meyerozyma e Torulaspora. As espécies Pichia kudriavzevii e Candida glabrata foram abundantes em todos os períodos de fermentação, representando 45% e 29% do número total de leveduras isoladas, respectivamente. Também foram identificados isolados bacterianos pertencentes a 21 gêneros diferentes, incluindo bactérias do ácido láctico e bactérias aeróbias. O gênero Weissella foi o mais abundante nos primeiros dias de fermentação, representando 34,7% dos isolados da cana-de- açúcar, enquanto o gênero Lactobacillus predominou na fase mais tardia da fermentação, com 22,9% dos isolados. Sessenta e nove isolados inibiram o crescimento de Listeria monocytogenes in vitro e, dentre estes, 18 inibiram ao mesmo tempo L. monocytogenes, Escherichia coli e Bacillus subtilis. A análise da diversidade genética da comunidade bacteriana das amostras avaliadas indicou diferenças entre a cana in natura e a silagem após 28 dias de fermentação. O índice de riqueza de espécies do Domínio Bacteria reduziu 34,5% e 27,6% no grupo de leveduras após 28 dias de fermentação. Entretanto, os índices de diversidade foram semelhantes entre os períodos de fermentação avaliados. A análise de diversidade de Firmicutes e γ-Proteobacteria, indicou aumento de 40% na riqueza de membros do filo Firmicutes após 28 dias de fermentação e redução de 38,1% de representantes da Classe γ-Proteobacteria. A avaliação da composição da microbiota da silagem de cana-de-açúcar indicou o predomínio de algumas espécies de bactérias e leveduras durante a ensilage que poderão ser utilizadas como alvos para o desenvolvimento de aditivos visando melhorar a qualidade nutricional da silagem de cana-de-açúcar.Item Fungal Community profile of Zygopetalum maxillare and Zygopetalum mackayi (ORCHIDACEAE)(Universidade Federal de Viçosa, 2016-07-22) Veloso, Tomás Gomes Reis; Kasuya, Maria Catarina Megumi; http://lattes.cnpq.br/7872519897730290The orchids seeds are minute and easily dispersed by the wind. However, due to this reduced size there is no enough reserve tissue to allow seed germination, so that the nutrients uptake in the in the first steps of life cycle is done by the association to a mycorrhizal fungus. Once distinct orchids species associate can associate with distinct fungi is important to know for each orchid which are the fungi associate, because the conservation of threatened orchids requires the conservation of the fungi. Here, culture-depedent and independent on approaches were used for studying the fungal profile community of two orchid species, Zygopetalum maxillare, an epiphyte, and Zygopetalum mackayi, a terrestrial. The results of culture-independent methods showed fungi of Ascomycota as the majority present. Both Zygopetalum species associate with Sebacinaceae and Ceratobasidiaceae, however, while species of Ceratobasidiaceae are shared by both orchids, Sebacinaceae are not. These results were corroborated by the results of culture-dependent approaches, although no fungi of Ceratobasidiaceae could be isolated. The isolates obtained by this study are potential to be used in seed germination and seedling development of Z. maxillare and Z. mackayi and for future use in reintroduction program.Item Diversidade e potencial antagonista de bactérias sob o efeito do uso da terra em solos de pastagem e de floresta na bacia Amazônica(Universidade Federal de Viçosa, 2016-07-15) Silva, Thamar Holanda da; Silva, Cynthia Canêdo da; http://lattes.cnpq.br/6590324509088247Os microrganismos exercem uma ampla diversidade de funções no solo e atuam como indicadores capazes de refletir pequenas mudanças nas propriedades desse, antes mesmo que alterações nos teores de matéria orgânica possam ser detectados, tornando possível evidenciar alterações antrópicas no solo. Devido à contínua ação antrópica sobre os solos existe uma grande necessidade de se estudar como as comunidades microbianas tem respondido a estas alterações. Este trabalho teve como objetivos analisar a diversidade taxonômica e funcional da comunidade bacteriana em solos de pastagem e solos de floresta Amazônico através de técnicas independentes de cultivo, bem como o isolamento de bactérias e leveduras que tivessem potencial antagonista contra fitopatógenos. As análises filogenéticas mostraram que os filos mais abundantes em ambos os ambientes foram Acidobacteria, Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes e Chloroflexi, porém uma maior diversidade foi encontrada nos solos de pastagem. Na análise funcional foi possível notar que o ambiente de pastagem obteve um maior número de genes relacionados à dormência/esporulação, resposta ao stress e metabolismo de aminoácidos. Genes associados com resistência a antibióticos foram menos abundantes em pastagem do que em floresta, concluindo que os solos de floresta são mais estáveis e menos susceptíveis a ação de fitopatógenos oportunistas quando comparados aos de pastagem. Um total de 54 microrganismos foram isolados das amostras de solo, destes, 45 bactérias e nove leveduras. Duas bactérias, identificadas como Bacillus spp. e Lysinibacillus xylanilyticus, e quatro leveduras apresentaram percentuais de inibição contra Botrytis cinerea, os percentuais de inibição variaram de 19,69% a 44,16 %. Quando testados contra Fusarium oxysporum apenas três isolados de leveduras foram os responsáveis pelos resultados positivos em relação ao controle, com percentuais de 33,11 % a 36,63%. Contra Colletotrichum acutatum cinco isolados de levedura foram capazes de reduzir o tamanho do fitopatógeno, com percentuais variando de 35,53% a 48,64%. Sendo assim os isolados mostraram-se favoráveis para o biocontrole dos patógenos testados.Item Diversidade bacteriana e impacto de um coquetel de bacteriófagos no crescimento de bactérias isoladas de um produto minimamente processado(Universidade Federal de Viçosa, 2016-10-07) Madeira, Rodrigo Oliveira; Paula, Sérgio Oliveira de; http://lattes.cnpq.br/9501308755513804Bacteriófagos também chamados de fagos são vírus que infectam somente células bacterianas. Fagos são divididos em grupos com base no seu ciclo de replicação, o ciclo lítico que causa a lise da bactéria hospedeira com a liberação de múltiplas partículas do fago (vírion), e o ciclo lisogênico onde o DNA do fago é incorporado ao genoma de seu hospedeiro, não resulta na lise do hospedeiro. Fagos líticos apresentam potencial para aplicação na indústria de alimentos como agentes de biocontrole, biopreservativos. Os fagos também foram propostos como alternativas aos antibióticos na agropecuária. Duas características dos fagos que os tornam potenciais ferramentas para biossegurança de alimentos são que eles não apresentam risco para células de eucariotos e possuem alta especificidade de hospedeiro, não interferindo com a microbiota mutualística e comensal. Esse trabalho avaliou diversidade da comunidade bacteriana cultivável de uma salada no pote (ready-to-eat/RTE) produzida em Viçosa-MG, o impacto in vitro de bacteriófagos de Escherichia coli (E.coili) e Staphylococcus aureus (S. aureus) nesses isolados bacterianos, e o perfil de resistência aos antibióticos desses isolados. Para isso foi realizado isolamento de bactérias do RTE, sequenciamento dos isolados pela plataforma Illumina miseq, e curvas de crescimento de densidade óptica dos isolados em contato com diferentes concentrações (MOI) do coquetel de fagos. Foram obtidos 213 isolados bacterianos, foi observado que o coquetel de bacteriófagos montado foi capaz de inibir o crescimento de apenas 2 dos 43 isolados testados. Com os resultados obtidos nesse trabalho foi possível concluir que havia presença de bactérias patogênicas no RTE e que o coquetel de bacteriófagos de E.coli e S. aureus não foi capaz de reduzir o crescimento de bactérias diferentes das quais esses fagos foram prospectados.Item Diversidade viral em amostras de solo: padronização e validação metodológica e estudo da diversidade viral em amostras de solo da região Amazônica(Universidade Federal de Viçosa, 2016-08-23) Abe, Aneli Eiko; Silva, Cynthia Canêdo da; http://lattes.cnpq.br/7976033621563169A floresta Amazônica é a maior e mais diversa floresta tropical do mundo, localizada em nove países da América do Sul, sendo a maior parte presente em território brasileiro, nas regiões Norte e Centro-Oeste. Até a década de 1970, a Amazônia brasileira era pouco explorada, porém após criação de projetos para ocupação e desenvolvimento do local, iniciou-se a migração para essas regiões, e regiões de floresta foram transformadas em áreas de cultivo agrícola e pastagem. Assim, o presente trabalho teve o objetivo de acessar a diversidade viral em amostras de solo de floresta e pastagem da bacia do Rio Mutum Paraná, no estado de Rondônia, por meio do sequenciamento do metagenoma e microscopia eletrônica de transmissão (MET) de concentrado viral. Entretanto, para isso foi feita a padronização de metodologias para o estudo da diversidade viral em amostras de solo e avaliação do efeito de diferentes sistemas de fertilização sobre diversidade viral em solos de áreas de cultivo agrícola, localizados na área da Universidade Federal de Viçosa. Os resultados da padronização de metodologias para concentração viral por ultracentrifigação, polietilenoglicol (PEG) e membrana HA, mostraram que esta última apresentou os resultados mais satisfatórios, quando a diversidade viral foi acessada por meio de RAPD e MET. O material preparado para o MET foi o que teve menor background, ao passo que a concentração viral por PEG foi a que apresentou os piores resultados para a amostra de solo analisada. Os resultados obtidos no estudo do efeito dos diferentes fertilizantes utilizados mostraram por meio de RAPD e MET que a combinação dos fertilizantes orgânico e inorgânico aumentam a diversidade viral. Em relação às amostras de solo de floresta e pastagem da bacia do Rio Mutum Paraná, a análise taxonômica das sequências do metagenoma pelo MetaVir mostraram que o solo de pastagem apresentou maior número de famílias virais. Em ambas as amostras, os vírus de DNA dupla fita foram os mais abundantes. Dentre os vírus caudados, as famílias Myoviridae e Siphoviridae foram as mais abundantes para as duas amostras analisadas. As análises morfológicas pelo MET mostraram que as amostras de floresta apresentaram maior diversidade morfológica viral, com relação às amostras de pastagem.Item Solubilização de fosfatos por Aspergillus niger, Penicillium islandicum e ácidos orgânicos(Universidade Federal de Viçosa, 2016-07-21) Duarte, Josiane Leal; Costa, Maurício DutraO uso de micro-organismos solubilizadores de fosfato (MSF) constitui alternativa viável para produção agrícola sustentável, devido á redução do consumo de adubos fosfatos solúveis de elevado custo. Os MSF podem potencialmente mobilizar P a partir de fosfatos de rocha pouco reativos ou a partir do solo. Assim, o objetivo deste trabalho foi o de avaliar a solubilização de oito fosfatos naturais distintos (Araxá, Catalão, Bayovar, Argélia, Abaeté, Patos de Minas, crandalita e Gafsa) por Aspegillus niger FS1 ou Penicillium islandicum FS41 e alguns de seus metabólitos ácidos. Adicionalmente, avaliou-se a mobilização de P a partir de uma fração granulométrica < 75 μm de dois Latossolos distintos pelos ácidos cítrico e oxálico. O isolado de A. niger FS1 foi o mais eficiente em solubilizar a maioria dos fosfatos naturais testados. O P solúvel não se correlacionou com as concentrações de ácido oxálico e cítrico detectadas no meio de cultura, sugerindo que a maior solubilização de P por A. niger FS1 resultou da extrusão de H + e, ou da ação de outros metabólitos ácidos não detectados. A crandalita foi a fonte de P mais recalcitrante à solubilização microbiana. Para a solubilização de fosfato de Araxá e Catalão, o ácido oxálico, a 50 mmol L -1 , foi o mais eficiente na solubilização de P. Observou-se interação sinérgica entre o ácido cítrico e o málico na solubilização dos fosfatos de rocha testados. O ácido oxálico foi capaz de disponibilizar P a partir da fração de 75 μm do Latossolo de Patos de Minas, levando a aumentos de até 9 vezes na concentração de P solúvel em comparação ao tratamento controle, sem ácido. O efeito do ácido oxálico foi solo-específico, não ocasionando aumentos significativos no P solúvel no Latossolo TG. O tratamento da fração < 75 μm dos solos com ácido cítrico levou à redução ou a pequenos aumentos no P solúvel, a depender do tipo de solo e horizonte avaliado. Este trabalho demonstrou a ampla diversidade de fosfatos naturais passíveis de sofrerem solubilização microbiana. O ácido oxálico foi mais eficiente em solubilizar a maioria das fontes de P testadas, bem como aquelas nativas de um dos solos testados. Os dados obtidos evidenciaram pela primeira vez o potencial do ácido oxálico em aumentar a disponibilidade de P em solução a partir da fase sólida do solo. O uso de micro-organismos e de seus metabólitos na disponibilização de P a partir de fontes pouco solúveis pode contribuir para a realização de práticas agrícolas menos custosas do ponto de vista econômico e ambiental.
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