Microbiologia Agrícola
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Item Hidrofobicidade celular e biossurfactantes como determinantes da capacidade desemulsificante de isolados bacterianos(Universidade Federal de Viçosa, 2011-03-31) Fernandes, Rita de Cássia Rocha; Borges, Arnaldo Chaer; http://lattes.cnpq.br/1404894439547309A capacidade de culturas microbianas de desestabilizarem emulsões do tipo óleo em água (O/W) ou água em óleo (W/O), promovendo a separação de fases, é frequentemente atribuída a características como hidrofobicidade da superfície celular e a capacidade de produção de compostos com atividade surfactante e ação desemulsificante. Neste trabalho, foi avaliada a hipótese de que a capacidade de quebra de emulsões O/W ou W/O de isolados bacterianos está relacionada à hidrofobicidade celular e à produção de biossurfactantes com ação desemulsificante. As bactérias com capacidade desemulsificante foram isoladas a partir de composto de resíduo sólido urbano contaminado com óleo diesel, após enriquecimento em meio mineral contendo parafina líquida como fonte de carbono (MMSM-parafina). O agrupamento gerado com base no perfil de ácidos graxos dos 23 isolados obtidos distinguiu a presença de doze linhagens bacterianas, das quais quatro foram eficientes para quebra de emulsão W/O, sendo a razão de quebra de emulsão maior que 70%. Essas bactérias foram identificadas como Acinetobacter sp. (LBBMA LU3 e LBBMA 7a) e Pseudomonas mendocina (LBBMA LU5b e LBBMA LU7b). Nenhuma delas produziu biossurfactantes ou foi capaz de quebrar emulsão do tipo O/W. Os dados demonstram que a produção de biossurfactantes não é requerida para promover a quebra de emulsões W/O; contudo, indicam que esses compostos podem ser requeridos para a quebra de emulsões do tipo O/W. A capacidade de quebra de emulsão W/O diminuiu com o tempo de crescimento das culturas e foi dependente da presença de células com até 22 horas de cultivo em meio MMSM-parafina, não havendo influência de componentes do sobrenadante. Ao contrário, a atividade desemulsificante de culturas mais velhas e, em especial, a capacidade de separar a fase oleosa contida nas emulsões, foram atribuídas à presença de compostos desemulsificantes sem atividade surfactante. A atividade desemulsificante de Acinetobacter sp. LBBMA LU3 aumentou linearmente com o aumento da temperatura, não sendo afetada por salinidade (até 150 g L-1) ou pelo pH (3-8). Em algumas linhagens, foi observada a existência de uma possível interação entre células sedimentáveis e não-sedimentáveis numa mesma cultura, a qual determina a sua atividade desemulsificante. Na literatura especializada, não se encontra registro desse tipo de interação entre células distintas de uma mesma cultura bacteriana, em relação à sua atividade de quebra de emulsão W/O. Também, o efeito negativo de células não-sedimentáveis de algumas linhagens bacterianas sobre a separação da fase oleosa em emulsão W/O representa conhecimento novo para a área. A integridade das células de Acinetobacter sp. LBBMA LU3 não é necessária para a atividade desemulsificante. A utilização de células de uma mesma linhagem bacteriana com diferentes valores de hidrofobicidade de superfície celular, obtidas durante a desnutrição em meio com carência de nitrogênio, revelou que inexiste uma relação única entre hidrofobicidade celular e capacidade de quebra de emulsão W/O. A hidrofobicidade celular correlaciona-se tanto positiva como negativamente com a capacidade de quebra de emulsão W/O e com a capacidade de separação de querosene contido na emulsão. Conclui-se, portanto, que outras características da superfície celular bacteriana, e não a sua hidrofobicidade, são determinantes para a sua atividade desemulsificante.Item Solubilização de fosfatos de rocha por Penicillium islandicum(Universidade Federal de Viçosa, 2018-02-23) Bonduki, Victor Hugo Araújo; Costa, Maurício Dutra; http://lattes.cnpq.br/0594143652004072O consumo de fertilizantes minerais aumenta anualmente com vistas a melhorar a produtividade das lavouras. Os fertilizantes fosfatados estão entre os mais comercializados em razão da importância do fósforo (P) para o crescimento, o desenvolvimento e a produção vegetal em solos empobrecidos desse nutriente. Nos solos brasileiros, a disponibilidade de P é baixa e, na maioria das vezes, o elemento torna-se inacessível às raízes em face de sua retenção nos minerais de argila. Para contornar esse problema, o uso de fontes alternativas de P em substituição aos fertilizantes solúveis dispendiosos têm sido estudadas. Para suprir a demanda de mercado, os fosfatos naturais ou de rocha (FRs), fontes de P, são tratados por processos químicos e térmicos de elevado custo energético que causam poluição. Os FRs brasileiros são de baixa reatividade, fazendo com que o seu processamento seja mais oneroso. Esse fato desestimula o uso de reservas de rocha fosfáticas nacionais, levando à importação de FRs estrangeiros de maior reatividade. Uma alternativa viável para o uso de FRs brasileiros é a utilização de microrganismos com capacidade de solubilizar esse material por meio de processos biológicos de acidificação do meio e complexação de cátions. A solubilização microbiana tem também a vantagem de permitir a utilização de substratos sólidos para o crescimento microbiano, geralmente rejeitos ou resíduos da indústria agrícola. O objetivo do presente trabalho foi o de estudar a solubilização microbiana de FRs por P. islandicum FS41 em meios líquidos e em sistema de fermentação em substrato sólido com bagaço de cana-de-açúcar. A capacidade fúngica de solubilizar os FRs de Araxá, Catalão, Patos de Minas, Bayóvar e Argélia foi testada neste trabalho. O P. islandicum FS41 imobilizou o P liberado em meio Strasser, em fermentação em substrato sólido, quando na presença dos FRs de Araxá, Catalão e Patos de Minas. Os FRs Argélia e Bayóvar apresentaram valores baixos de P em solução, correspondendo a 18,9 e 9,8 mg L-1, respectivamente. A diminuição da disponibilidade de nitrogênio, atrelada à utilização de fontes amoniacais no meio Strasser, no sistema de fermentação em substrato sólido, promoveu aumentos do P em solução para os FRs Argélia, Bayóvar, Patos de Minas e Araxá. A ausência de fontes nitrogenadas ixinorgânicas e de extrato de levedura, no meio Strasser e no mesmo sistema de fermentação, favoreceu a liberação de P a partir do FR de Araxá, com valor de P em solução de 47,9 mg L-1 ou cerca de 11 % de solubilização. A solubilização dos FRs por P. islandicum FS41 foi mais eficiente em meio NBRIP do que no meio Strasser em sistema de cultivo em batelada em meio líquido, com valores médios de P em solução de 96,7, 79,7, 26,9, 23,2 e 22,3 mg L-1 para os FRs Argélia, Bayóvar, Patos de Minas, Catalão e Araxá, respectivamente. Alternativamente, o pré-cultivo de P. islandicum FS41 e a posterior transferência da biomassa micelial produzida para meio de solubilização com baixa disponibilidade de nutrientes minerais resultou em valores de P em solução de 130 mg L-1, o que correspondeu a 30 % de solubilização do P contido no FR de Araxá. Essa última estratégia promoveu aumentos de 2,71 a 5,8 vezes do P em solução em comparação aos valores obtidos nos experimentos anteriores. Diferentemente de outros fungos solubilizadores de fosfato, P. islandicum FS41 mostrou-se mais eficiente na produção de biomassa micelial, com forte tendência de imobilização do P liberado dos FRs. O presente trabalho aponta algumas alternativas de se contornar esse problema. No entanto, esforços adicionais deverão ser conduzidos para a otimização do processo de solubilização de FRs por esse fungo.Item Sistemas de recuperação de ribossomos em Actinobacillus pleuropneumoniae: papel em virulência e resposta a diferentes condições de estresse(Universidade Federal de Viçosa, 2018-07-27) Teixeira, Ana Carolina Nery; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://lattes.cnpq.br/1967721199398909A pleuropneumonia suína é uma doença respiratória causada pelo patógeno bacteriano Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) cujo sucesso na colonização e permanência nos pulmões do suíno está relacionado à sua capacidade de resistência a diferentes condições de estresse e a inúmeros fatores de virulência. Para o sucesso do patógeno, a síntese proteica eficiente é um gargalo, uma vez que este processo pode ser um fator limitante durante o crescimento e replicação bacterianos, e para isso há uma expressiva necessidade de ribossomos ativos dentro da célula. Em condições de estresse, os ribossomos podem ficar parados em uma fita de mRNA quando um códon de parada não é detectado, precisando, portanto, de um resgate ativo em um processo chamado trans-tradução. Um RNA pequeno denominado tmRNA, ubíquo em bactérias, codificado pelo gene ssrA, é responsável por mediar o mecanismo de trans-tradução. Muitas bactérias ainda apresentam dois sistemas adicionais mediados pelo fator de resgate alternativo A (alternative rescue factor A), ArfA, descrito em outras bactérias como Escherichia coli, Salmonella enterica e Yersinia pestis e o fator de recuperação alternativo B (alternative rescue factor B), ArfB presente em 34% dos genomas bacterianos já sequenciados. Este trabalho teve como objetivos investigar qual(is) sistema(s) de recuperação de ribossomos está(ão) presente(s) em A. pleuropneumoniae e qual o envolvimento deste(s) na virulência e na resposta a diferentes condições de estresse. Análises in silico e in vitro foram conduzidas com este propósito. Nossos resultados in silico mostraram que A. pleuropneumoniae possui apenas dois sistemas de recuperação de ribossomos, e o fato de não conseguirmos a obtenção de uma linhagem duplo mutante (∆ssrA_∆arfA) valida nosso resultado. Para verificar o envolvimento destes genes em virulência e resposta a condições de estresse, linhagens mutantes denominadas ∆ssrA e ∆arfA, bem como linhagens complementadas para as respectivas linhagens, ∆ssrAC e ∆arfAC, respectivamente, foram construídas a partir da linhagem APP MIDG2331 WT (sorotipo 8). Estas linhagens (WT, mutantes e complementadas) foram investigadas quanto ao crescimento in vitro, adesão, sensibilidade a antibióticos e a diferentes condições de estresse (oxidativo, osmótico, temperatura e etanólico). Além disso, a virulência destas linhagens foi analisada no modelo de infecção alternativo Galleria mellonella. Análises fenotípicas mostraram que o mutante ∆ssrA foi mais sensível antibióticos e a todas as condições de estresse se comparado à linhagem WT e ao mutante ∆arfA. Além disso, o mutante ∆ssrA apresentou menor capacidade de adesão e virulência atenuada em G. mellonella quando comparada com as linhagens WT e ∆arfA. A linhagem ∆ssrAC não mostrou uma restauração completa do fenótipo original. Entretanto, a linhagem ∆arfAC mostra uma restauração completa do fenótipo. Estes resultados mostram que o gene ssrA tem um papel importante na resistência ao estresse e na virulência em APP e a ausência do gene arfA não afetou o fitness da bactéria nas condições avaliadas. Diante desses resultados, podemos concluir que o sistema TmRNA/SmpB é o principal sistema de recuperação de ribossomos em A. pleuropneumoniae e que a falta do mesmo acarreta em atenuação do fenótipo de virulência e aumento da sensibilidade a condições de estresse.Item Resistência térmica de Alicyclobacillus acidoterrestris em sucos de frutas tropicais em diferentes valores de pH, temperatura e na presença de bacteriocinas(Universidade Federal de Viçosa, 2012-02-16) Oliveira, Wemerson de Castro; Mantovani, Hilário Cuquetto; 4906043209502220 Última atualização do currículo eA deterioração de sucos de frutas pela bactéria termoacidófila e esporulante Alicyclobacillus acidoterrestris acarreta prejuízos econômicos para a indústria de alimentos. Para evitar a deterioração e garantir a qualidade dos alimentos, técnicas de inativação microbiana têm sido conjugadas visando aumentar a eficiência do processamento de alimentos. Nesse trabalho foi analisado o efeito do pH, da temperatura e de duas bacteriocinas sobre a resistência térmica de endósporos de A. acidoterrestris DSM 2498 inoculado em diferentes sucos de frutas tropicas. Os efeitos mais pronunciados de inativação térmica dos endósporos de A. acidoterrestris foram obtidos nos valores de pH mais ácidos, sendo que o menor valor D (1,65 min) ocorreu a 95oC no suco de mamão com pH 2,5. Em contraste, o maior valor D (24,6 min) foi obtido na temperatura de 90°C no suco de maracujá com pH 4,5. Para os sucos de mamão e goiaba submetidos à temperatura de 95 oC, não houve diferença nos valores D quando o pH dos sucos foi ajustado para 2,5 ou 4,5. Constatou-se, pela análise de regressão polinomial, que a interação pH e temperatura apresentou maior influência na inativação térmica dos endósporos de A. acidoterrestris. Quando foi testado o efeito das bacteriocinas bovicina HC5 e nisina sobre a resistência térmica de endósporos de A. acidoterrestris, observou-se que a bovicina HC5 diminuiu mais acentuadamente a resistência térmica dos endósporos quando comparado à nisina. Os tratamentos mais eficazes foram aqueles onde os endósporos de A. acidoterrestris foram tratados com bovicina HC5 a 95°C nos sucos de mamão e maracujá. O tratamento com bovicina HC5 aumentou a eficiência do processamento térmico a 95 °C em 42,3% comparado ao controle, sendo ainda 27,8% mais eficaz do que a nisina nesta temperatura de processamento. Para a temperatura de 90 oC, os valores D indicaram menor resistência térmica dos endósporos de A. acidoterrestris em suco de mamão tratado com bovicina HC5 (D90°C= 2,3 min) e maior resistência térmica em suco de abacaxi sem aditivos (controle, D90°C= 8,4 min). Os resultados obtidos neste estudo indicam que o efeito combinado de pH e temperatura é eficaz contra endósporos de A. acidoterrestris e que viiias bacteriocinas bovicina HC5 e nisina reduzem a resistência térmica dos endósporos de A. acidoterrestris, demonstrando potencial para uso como biopreservativo de sucos de frutas.Item Biossurfactantes e Polímeros de Bacillus subtilis RI4914 e sua Aplicação em Recuperação Avançada de Petróleo(Universidade Federal de Viçosa, 2011-09-01) Fernandes, Péricles Leonardo; Tótola, Marcos Rogério; 9781385135118198Neste trabalho foram realizados experimentos com o intuito de avaliar-se a propriedade dos biossurfactantes produzidos pelo isolado Bacillus subtilis RI4914 em reduzir a tensão interfacial e promover a recuperação de óleo residual em colunas empacotas com areia. Foi observado que a solução de biossurfactantes é capaz de mobilizar até 40% do óleo residual das colunas, porém somente em concentrações elevadas (2,0 g L-1). Por outro lado, a utilização do sobrenadante da cultura do isolado RI4914 proporcionou recuperação de óleo superior à alcançada com a solução dos biossurfactantes e em concentração dez vezes menor da molécula. Tais resultados indicam a produção de compostos capazes de atuar sinergisticamente com os biossurfactantes na redução da tensão interfacial, alcançando valores de até 0,07 mN/m. Além disso, destaca- se a produção espontânea de polímero pela bactéria, molécula esta capaz de aumentar a viscosidade do sobrenadante e reduzir quase que pela metade o volume necessário para uma recuperação satisfatória de óleo residual. Os biossurfactantes apresentaram características físico-químicas comparáveis às do surfactante sintético SDS. Em termos de estabilidade, as moléculas demonstraram ter sua atividade pouco influenciada por condições extremas, principalmente no que se diz respeito às altas temperaturas. Esses resultados foram comprovados quando o sobrenadante da cultura foi avaliado quanto a sua capacidade em promover a recuperação do petróleo residual em salinidades variando entre 3 e 10% (p/v) de NaCl e em uma faixa de pH de 6,0 a 9,0. A recuperação de óleo pelo sobrenadante da cultura demonstrou ser também pouco influenciada pelas condições ambientais testadas, chegando a recuperar 88% do petróleo residual na presença de polímero. Esses resultados comprovam que os biossurfactantes descritos neste trabalho são substitutos em potencial para os surfactantes sintéticos frequentemente utilizados na indústria do petróleo.Item Efeito de salinidade, pH, concentração de células e hidrofobicidade celular sobre a recuperação de petróleo em sistema poroso por Acinetobacter sp(Universidade Federal de Viçosa, 2012-02-28) Nobre, Patrícia Bernardes; Tótola, Marcos Rogério; 0788152971047858Considerando-se o cenário de aumento da demanda de energia no mundo e a depleção dos reservatórios de petróleo, o desenvolvimento de novas tecnologias de exploração, que propiciem aumento da capacidade de recuperação de óleo, é estratégico para a garantia do suprimento de energia. Neste trabalho, avaliou-se a capacidade das células de Acinetobacter sp. LBBMA LU1 em promover a recuperação de óleo residual em sistema poroso não- consolidado. A injeção da suspensão de células de Acinetobacter sp. reduziu a saturação de óleo residual, em todas as concentrações testadas. Após a injeção da suspensão de células (4 volumes porosos, D.O.600 = 10,0), apenas 26,0 % do óleo retido na coluna nela permaneceram. Esse valor foi reduzido para 22 % quando se utilizou suspensão com maior concentração de células (D.O.600 = 20,0). O total de óleo recuperado pela injeção de solução salina (recuperação secundária) e de suspensão de células (recuperação terciária) foi superior a 80% do volume de óleo originalmente contido nas colunas. A alta hidrofobicidade das células concorreu para a recuperação do petróleo residual, juntamente com fatores que influenciam a estabilidade da atividade celular, como a temperatura, o pH e a salinidade. O tratamento de esterilização da suspensão de células de Acinetobacter sp. LBBMA LU1 por autoclavagem, antes da injeção, demonstrou que a integridade das células é de importância para o processo de recuperação do petróleo residual. O efeito da variação do pH sobre a retenção de óleo em colunas mostrou-se pronunciado; no tratamento com pH 8,5, a recuperação foi 34 % maior do que a obtida no tratamento-controle (pH 7,4). Em pH 9,5, a recuperação foi 18 % superior à do controle. A salinidade do líquido de injeção das células (50 ou 100 g L-1) exerce expressiva influência sobre a saturação residual de petróleo, como demonstrado pela retenção do equivalente a cerca de 30 % a mais de petróleo do que no controle (sem adição de sal). Em resumo, conclui-se que a expressiva recuperação de óleo residual em sistema poroso não consolidado, resultante da injeção de células de Acinetobacter sp. LBBMA LU1 em suspensão, com acidez e salinidade definidas, demonstra o potencial da bactéria para inclusão em estudos a respeito de estratégias de recuperação avançada de petróleo.Item Acumulação de lítio por Basidiomicetos(Universidade Federal de Viçosa, 2012-12-16) Nunes, Mateus Dias; Kasuya, Maria Catarina Megumi; 4008301306049855Cogumelos são capazes de absorver e acumular lítio, entretanto, ainda não existe estudos sobre quais espécies de basidiomicetos são mais sensíveis a lítio, quais formas de lítio prejudicam mais o desenvolvimento dos fungos e dos cogumelos e qual a capacidade de absorção de lítio pelos cogumelos. Neste estudo, verificou-se que, dentre os 11 fungos avaliados, Pleurotus ostreatusroseus, Pholiota nameko e Pleurotus ostreatus são os menos sensíveis às diferentes formas de lítio testadas. O Li2SO4 é a forma de lítio que menos prejudicou o crescimento micelial dos fungos estudados. As formas e as concentrações de lítio testadas não prejudicam a formação e a produtividade dos cogumelos. P. ostreatus acumula, cerca de, 16% da concentração de lítio presente nos substratos, independentemente do tempo de interação do micélio com o substrato. Entretanto P. ostreatusroseus aumenta a acumulação de lítio com o tempo, assimilando até 90 % do lítio adicionado ao substrato Nossos resultados sugerem os fungos do gênero Pleurotus são acumuladores de lítio, mas que o P. ostreatusroseus apresenta maior potencial para ser utilizado na produção de cogumelos enriquecidos com esse mineral.Item Bioconversão de glicerina bruta da indústria do biodiesel em 1,3- propanodiol por bactérias isoladas de amostras ambientais(Universidade Federal de Viçosa, 2011-03-18) Melo, Marcelo Rodrigues de; Mantovani, Hilário Cuquetto; 9387195648186878O biodiesel é produzido por meio de reações de transesterificação entre óleos vegetais ou gorduras animais e álcoois (metanol ou etanol), resultando na formação de ésteres metílicos ou etílicos e glicerina bruta. Composto por glicerol, sabões, álcool, sais inorgânicos, ácidos graxos livres e outras matérias orgânicas, esse co- produto da indústria do biodiesel pode ser utilizado como substrato para produção microbiana de 1,3-propanodiol. Este diol tem sido produzido principalmente por vias petroquímicas e utilizado na produção de poliésteres, poliéteres, poliuretanos, solventes, adesivos, laminados, resinas, detergentes, anticongelantes e cosméticos. Neste trabalho, amostras de líquido de rúmen, solo, esgoto e dejetos suínos foram enriquecidas em meio contendo 5 % (v/v) de glicerina bruta, resultando no isolamento de 48 culturas produtoras de 1,3-propanodiol. As amostras de solo, esgoto e dejetos suínos contribuíram com 31, 12 e cinco culturas, respectivamente. Duas dessas culturas foram selecionadas para novos estudos e identificadas como Clostridium butyricum Sb06 e Klebsiella pneumoniae Ec18. K. pneumoniae Ec18 apresentou crescimento em concentrações de substrato (glicerol ou glicerina bruta) e 1,3-propanodiol de 200 e 80 g/L, respectivamente. Por outro lado, o crescimento de C. butyricum Sb06 foi totalmente inibido em concentrações de 160 e 40 g/L de substrato e 1,3-propanodiol, respectivamente. O crescimento dos isolados C. butyricum Sb06 e K. pneumoniae Ec18 foi favorecido em condições de neutralidade e os produtos da fermentação mais inibitórios ao crescimento foram o butirato e o acetato, respectivamente. O crescimento de C. butyricum Sb06 em meio basal, com e sem controle do pH do meio de cultivo, foi limitado a concentração de aproximadamente 1,5 g/L de biomassa, o que limitou a produção de 1,3-propanodiol em 10,23 g/L, com rendimento de 0,56 mol1,3-propanodiol/molglicerol. O controle do pH do meio de cultivo de K. pneumoniae Ec18 resultou em aumento de 2,5 vezes na formação de biomassa e produção 13,96 e 21,43 g/L de 1,3-propanodiol, com rendimento de 0,43 e 0,42 mol1,3-propanodiol/molglicerol, em meio contendo 40 e 80 g/L de glicerina bruta, respectivamente. As condições de cultivo de K. pneumoniae Ec18, na presença de 80 g/L de glicerina bruta, foram otimizadas utilizando de forma sequencial o delineamento fatorial fracionado e a metodologia de superfície de resposta, resultando em aumento de 56 % na concentração final de 1,3-propanodiol e de 22 % no rendimento de 1,3-propanodiol, em relação ao cultivo nas condições não- otimizadas. Os resultados deste trabalho indicam que o isolado K. pneumoniae Ec18 possui potencial para bioconversão de glicerina bruta em 1,3-propanodiol. Entretanto, outros estudos deverão ser realizados para a adequação do sistema de cultivo e a redução da formação de co-produtos da fermentação que competem com a formação de 1,3-propanodiol.Item Domínios funcionais em Cel9B de Thermobifida fusca e prospecção de celulases bacterianas(Universidade Federal de Viçosa, 2011-04-20) Filho, José Carlos de Oliveira; Borges, Arnaldo Chaer; 621966657609179Thermobifida fusca Cel9B, também denominada de E1, é uma endoglucanase muito ativa sobre carboxi-metil celulose. É composta pelo domínio catalítico (CD) da família 9 ligado a um domínio de ligação a carboidrato da família 4 (CBM4), seguido por um domínio tipo imunoglobulina na extremidade amina e um domínio de ligação a carboidrato da família 2 (CBD2), ligado ao CD por um linker na extremidade carboxílica da proteína. Para estudar o papel do domínio catalítico e dos dois domínios de ligação a carboidratos presentes nessa enzima, foram construídas três formas variantes, clonadas e expressas em Escherichia coli. As massas moleculares de E1 e suas formas variantes foram determinadas por espectrometria de massa, e os valores obtidos foram correspondentes àqueles preditos in silico a partir da sequência de DNA. A enzima tipo selvagem e suas formas variantes foram purificadas e ensaios enzimáticos e de ligação foram realizados sobre vários substratos. O domínio catalítico mostrou as maiores atividades sobre os substratos celulósicos, porém a presença de CBD2 melhorou seu desempenho enzimático sobre celulose microcristalina e celulose amorfa tratada com ácido fosfórico, substratos nos quais detectou-se ligação de CBD2. Adicionalmente, a presença desse domínio auxiliou na degradação de xiloglucana. CBD2 apresentou ligação a α-quitina, porém E1 não possui atividade sobre esse polímero. CBM4 interferiu negativamente na degradação dos substratos celulósicos e também xiloglucana porque sua presença diminuiu a atividade enzimática nesses casos. Por outro lado, a presença de CBM4 melhorou o desempenho enzimático do CD de Cel9B sobre xilana, porém sua ligação a esse substrato não foi detectada. O alinhamento de membros da família de CBM4 de Cellulomonas fimi, Thermotoga maritima e T. fusca mostrou que resíduos de aminoácidos aromáticos envolvidos na ligação ao substrato estão presentes em posições conservadas em E1 e o modelo gerado para sua estrutura mostrou região potencial para ligação de substrato. Neste trabalho foi obtido também um banco de bactérias celulolíticas provenientes do solo da mata do Belvedere, crescimento secundário de mata Atlântica, e do solo de mata de eucalipto, plantada na mesma região. O meio ágar arginina glicerol foi o mais eficaz para o isolamento de bactérias celulolíticas a partir do solo de mata do Belvedere ou mata de eucalipto, porém o meio ágar extrato de solo demonstrou um maior potencial para isolamento de microrganismos diversos, uma vez que proporcionou o crescimento exacerbado de fungos, não presentes nas mesmas condições nos outros meios. Os isolados mostraram diversidade de características macro e microscópicas, sendo em sua maioria organismos Gram positivos, e das 317 bactérias isoladas, 57 foram detectadas como produtoras de celulases pelo teste de celulose azure. O isolado 103 possui o conjunto de celulases mais ativas contra esse substrato, nas condições testadas. Este isolado é o candidato para continuação dos estudos nesta linha de pesquisa no laboratório de Microbiologia Industrial da Universidade Federal de Viçosa. A diversidade de enzimas celulolíticas obtidas pode propiciar o uso de seus determinantes genéticos em evolução direcionada às características requeridas para processos industriais de bioconversão de resíduos celulósicos.Item Caracterização molecular de diferentes sorotipos de Actinobacillus pleuropneumoniae obtidos no Sudeste do Brasil(Universidade Federal de Viçosa, 2011-07-18) Rossi, Ciro César; Bazzolli, Denise Mara Soares; 1054546991930547Actinobacillus pleuropneumoniae é o principal micro-organismo responsável pela pleuropneumonia suína. A existência de 15 diferentes sorotipos descritos para esta bactéria, com diferentes graus de virulência, torna de grande importância a sorotipagem, o estudo de fatores de virulência e o acesso à variabilidade genética de isolados clínicos de A. pleuropneumoniae. Este trabalho demonstrou a aplicabilidade de duas técnicas de PCR (PCR multiplex com os genes apx e PCR-REA com o gene apxIVA) previamente desenvolvidas na caracterização dos sorotipos de A. pleuropneumoniae e representou o primeiro estudo de variabilidade genética desta bactéria no Brasil, padronizando técnicas moleculares inéditas no estudo deste micro- organismo. Os resultados mostram que os 91 isolados clínicos de A. pleuropneumoniae utilizados neste trabalho são dos sorotipos 2, 5, 7 e 8. Uma grande variabilidade genética nos isolados foi observada examinados pelas técnicas de ERIC-PCR, BOX-PCR e (GTG)5-PCR, o que pode estar relacionado à presença, em elevado número de cópias, do elemento transponível ISApl1 no genoma dos micro-organismos, uma vez que o genoma desta bactéria é relativamente pequeno (2,2 Mpb). A reação de BOX-PCR, particularmente, proporcionou um maior poder discriminativo, uma vez que um fragmento específico para isolados de A. pleuropneumoniae foi observado e a técnica permitiu a separação dos isolados em um maior número de grupos com base em características em comum, como sorotipo, região e ano de isolamento. Adicionalmente, ferramentas de bioinformática foram utilizadas para caracterizar o gene omlA, que codifica uma proteína da membrana externa de A. pleuropneumoniae e constitui um fator de virulência nesta bactéria. As análises demonstraram a conservação no promotor do gene e a existência de uma região conservada na estrutura da proteína OmlA, provavelmente envolvida na ligação da proteína à membrana da bactéria. O grande polimorfismo presente nas sequências interna e final do gene omlA dos 15 sorotipos permitiu separá-los por reconstrução filogenética e demonstrou a possível diferenciação destes sorotipos em dois eventos evolutivos distintos