Microbiologia Agrícola
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Item Caracterização morfológica e molecular de fungos micorrízicos de sete espécies de orquídeas neotropicais(Universidade Federal de Viçosa, 2001-11-29) Pereira, Olinto Liparini; Kasuya, Maria Catarina Megumi; http://lattes.cnpq.br/8856812652169427Sete fungos micorrízicos foram isolados de “pelotons” das orquídeas Epidendrum rigidum , Isochillus lineares , Maxillaria marginata , Oncidium flexuosum, Oncidium varicosum, Oceoclades maculata e Polystachia concreta. Todas essas orquídeas são nativas do Brasil, sendo O. maculata de habitat terrestre e as demais epífitas. Três isolados fúngicos foram classificados como Epulorhiza e quatro como Ceratorhiza, ambos pertencentes ao grupo Mycelia sterilia, basidiomicetos similares a Rhizoctonia. O fungo isolado de O. maculata foi classificado como sendo E. repens e os dois outros isolados classificados como Epulorhiza são idênticos entre si e diferenciaram-se das espécies já relatadas para esse gênero, podendo ser considerados como uma nova espécie. Dois isolados classificados como Ceratorhiza são idênticos e provavelmente pertencentes a uma mesma espécie, enquanto os outros dois diferem desses e também entre eles. Assim, esses isolados parecem pertencer a três espécies distintas de Ceratorhiza. Os agrupamentos efetuados após a caracterização morfológica e pelas técnicas moleculares de PCR-RFLP da região ITS do rDNA e de RAPD, foram condizentes. Este é o primeiro relato taxonômico da caracterização morfológica e molecular de fungos micorrízicos isolados de orquídeas brasileiras.Item Produção da micotoxina citrinina por Penicillium spp.(Universidade Federal de Viçosa, 2002-02-28) Vivan, Juliana; Coelho, Jorge Luiz Cavalcante; http://lattes.cnpq.br/8582025092660791O fungo Penicillium expansum, produtor de enzimas pectinolíticas e xilanolíticas, as quais possuem aplicação na indústria têxtil, na indústria de bebidas, principalmente na clarificação de sucos e vinhos, e na indústria de alimentos, está incluído entre as espécies toxigênicas capazes de produzir micotoxinas, dentre elas a citrinina. A presença dessa micotoxina inviabiliza a utilização de P. expansum na indústria de alimentos. Com o propósito de analisar a possibilidade desse fungo produzir simultaneamente as enzimas de interesse e a citrinina, foram verificadas seis linhagens de Penicillium , que vêm sendo utilizadas em estudos de produção de pectinases e xilanases na Universidade Federal de Viçosa. Dois métodos de análise, cromatografia em camada delgada (CCD) em sílica-gel e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) em fase reversa, foram utilizados com o único propósito de detectar citrinina. Dentre as seis linhagens, P. citrinum (principal produtor de citrinina ), P. expansum GF (linhagem toxigênica isolada de maçãs deterioradas), P. expansum VIC, P. griseoroseum , P. roqueforti e P. camemberti , apenas P. citrinum e P. expansum GF produziram citrinina nos três meios de cultivo testados (Timonin, YES e Aveia). P. roqueforti produziu citrinina apenas em caldo Timonin e os demais não a produziram em nenhum dos meios testados. Apenas o fungo P. citrinum foi capaz de produzir citrinina sob condições de incubação estática e em agitação rotacional a 150 rpm, em longos períodos de tempo (40 dias). O fungo P. expansum GF produziu a citrinina somente em condições estáticas, os demais fungos testados, P. expansum VIC, e P. roqueforti , também cultivados em ambas as condições, foram incapazes de produzir citrinina. Deste modo, pode-se concluir que os fungos P. expansum VIC e P. griseoroseum não representam perigo quanto à produção de citrinina, quando utilizados na indústria de alimentos, pois não têm capacidade de produzir a micotoxina nas mesmas condições em que produzem as enzimas de interesse, poligalacturonase e xilanase.Item Célula hospedeira ura3 para a produção de proteínas recombinantes em Kluyveromyces lactis(Universidade Federal de Viçosa, 2001-09-21) Medina, Pilar Ximena Lizarazo; Passos, Flávia Maria LopesFoi isolado um mutante auxotrófico para uracila de Kluyveromyces lactis com potencial para ser hospedeiro em sistemas de expressão heteróloga de proteínas recombinantes. Uma população selvagem de K. lactis foi irradiada com luz ultravioleta e selecionada na presença de ácido 5 fluoro orótico (5FOA). Dez colônias auxotróficas para uracila e resistentes a 5FOA foram selecionadas. Todas cresceram em meio utilizando lactose como única fonte de carbono e exibiram atividade de β galactosidase normal em relação à célula selvagem. Os mutantes apresentaram velocidades específicas de crescimento inferiores a da célula selvagem em soro de queijo ultrafiltrado (SUF), o que indicou ser o soro de queijo um meio limitante em uracila, afetando o crescimento dos mutantes. O mutante M7 foi selecionado por apresentar uma freqüência de reversão baixa (1,7 x 10 -10 ). A complementação da auxotrofia na linhagem M7 mediante transformação com o plasmídeo PTG802 contendo o gene URA3 de S. cerevisiae foi analisada. Melhor eficiência de transformação de K. lactis foi obtida com o método de choque térmico com acetato de lítio, polietilenoglicol e DNA carreador fita simples. Um transformante mostrou viiiintegração do plasmídeo em um fragmento de 6,0 Kb. A velocidade de crescimento da célula mutante (0,04 h -1 ) em SUF foi inferior a da célula selvagem (0,26 h -1 ). Estes resultados sugerem que o SUF é limitante em uracila. Conseqüentemente a transformação dos mutantes, com o gene URA3, fisiologicamente causou aumento na velocidade especifica de crescimento (0,22-0,25h -1 ) quando cultivadas em SUF, atingindo os níveis da célula selvagem e evidenciando a complementação da auxotrofia.Item Seleção de microrganismos para a conversão de xilose em xilitol(Universidade Federal de Viçosa, 2001-08-14) Sampaio, Fábio Coelho; Coelho, Jorge Luiz Cavalcante; http://lattes.cnpq.br/1456852698542148Foram avaliadas duzentos e cinquenta e duas leveduras isoladas do ambiente da indústria de laticínios, dezoito leveduras isoladas de frutos de café e onze fungos filamentosos da micoteca do Departamento de Microbiologia da Universidade Federal de Viçosa, para obtenção de xilitol a partir de D-xilose. Esses microrganismos foram cultivados em meio mineral D-xilose e 0,5% leveduras, que acrescido de 1% de de extrato de levedura, a 30°C e 100 rpm. Dezenove apresentaram produtividade volumétrica (Q P ) entre 0,06 e 0,12 g L -1 h -1 e rendimento (Y P/S ) de 0,14 a 0,57 g g -1 , foram selecionadas. Os fungos filamentosos apresentaram baixa produção de xilitol variando de 0,14 a 0,52 g L -1 , e leveduras produtividade volumétrica (Q P ) de 0,002 a 0,006 g L -1 h -1 . As selecionadas foram avaliadas numa segunda triagem, com padronização do inóculo inicial. Para seis isolados, a produção de xilitol variou de 4,60 a 6,23 g L -1 , a partir de 10,73 g L -1 de D-xilose com produtividade específica (q P ) entre 0,17 e 0,26 mmol g -1 h -1 , Q P =0,10 a 0,13 g L -1 h -1 e Y P/S =0,43 a 0,58 g g -1 . Destacou-se a levedura 1.70, produzindo 6,23 g L -1 de xilitol (Q P =0,13 g L -1 h -1 , q P =0,26 mmol g -1 h -1 e Y P/S =0,58 g g -1 ), a qual foi selecionada para determinação das melhores condições de cultivo. A melhor -1 concentração de D-xilose foi 51,35 g L , com produção de 32,70 g L -1 de xilitol (Q P =0,49 g L -1 h -1 , q P =0,49 mmol g -1 h -1 e Y P/S =0,64 g g -1 ). Utilizando 1,45 g L -1 de massa celular, como parâmetros inóculo inicial, foram obtidos os melhores fermentativos (36,2 g L -1 de xilitol a partir de 56,80 g L -1 de D-xilose, Q P =0,60 g L -1 h -1 , q P =0,58 mmol g -1 h -1 e Y P/S =0,65 g g -1 ). A melhor taxa de aeração foi obtida com 200 rpm, produzindo 27,20 g L -1 de xilitol a partir de 46,70 g L -1 de D-xilose (Q P =0,90 g L -1 h -1 , q P =0,74 mmol g -1 h -1 e Y P/S =0,57 g g -1 ). Para 0,5% de extrato de levedura 33,00 g L -1 de xilitol a partir de 50,00 g L -1 de q P =0,67 mmol g -1 h -1 levedura DIFCO e Y P/S =0,65 g g -1 ), e para MERCK , obteve-se D-xilose (Q P =0,64 g L -1 h -1 , 0,5% de extrato de obteve-se 33,65 g L -1 de xilitol a partir de 47,00 g L -1 de D-xilose (Q P =0,67 g L -1 h -1 , q P =0,60 mmol g -1 h -1 e Y P/S =0,72 g g -1 ). A levedura 1.70 foi caracterizada por provas fisiológicas, bioquímicas e morfológicas, visando a identificação de gênero e espécie. Entretanto, os resultados não foram conclusivos, apesar da semelhança morfológica com o gênero Pichia.Item Trocas gasosas, fluorescência da clorofila e crescimento de alfafa em resposta ao alumínio, ao pH e à relação cálcio:magnésio(Universidade Federal de Viçosa, 2002-04-19) Feitosa, Ávila Maria Bastos Santos; Borges, Arnaldo Chaer; http://lattes.cnpq.br/8680386497639364Este trabalho teve como objetivo o estudo dos efeitos do alumínio, do pH e da relação Ca:Mg sobre o crescimento, as trocas gasosas e a fluorescência da clorofila em alfafa no estádio de desenvolvimento R6 (um nó com uma flor aberta). No primeiro experimento, utilizou-se o fatorial completo 4 x 2 x 2, sendo quatro relações Ca:Mg (100:0, 75:25, 50:50 e 25:75), duas -1 concentrações de Al (0 e 50 μmol L^-1) e duas fontes de nitrogênio (simbiótico ou mineral) na solução nutritiva a pH 4,5. No segundo, utilizou-se um fatorial completo 4 x 2, sendo quatro relações Ca:Mg e dois valores de pH (5,0 e 6,0). Nos dois experimentos, as raízes das plantas foram inoculadas com a mistura das estirpes de Sinorhizobium meliloti, BR 7408 e BR 7409, sendo o Ca e o Mg adicionados na forma de sulfato. As plantas cultivadas com N simbiótico, na presença ou ausência do alumínio, apresentaram baixo desenvolvimento e ausência de nodulação, seguida de morte. Tal fato foi atribuído à atividade do íon hidrogênio. Os efeitos específicos das relações em mitigar a toxicidade da acidez e do alumínio foram comprovados pelo aumento na massa seca, na nodulação, na taxa fotossintética, na condutância estomática e na intensidade de coloração verde das plantas correspondentes ao tratamento com relação 75:25. A deficiência de magnésio nas plantas, na relação 100:0, induziu a limitações no crescimento, na taxa fotossintética por unidade de área foliar, na condutância estomática e na captura e transferência de energia pelo complexo antena. Os resultados evidenciaram que, quando prevalece a condição de acidez, há maior demanda de cálcio em relação à de magnésio para mitigar os efeitos tóxicos da acidez e do alumínio.Item Crescimento e caracterização de pectina liase de Paenibacillus amylolyticus isolado de frutos de café (Coffea arabica L.)(Universidade Federal de Viçosa, 2001-03-16) Paula, Evandro Marcus de; Silva., Daison OlzanyA bactéria Paenibacillus amylolyticus, isolada de frutos de café que tiveram sua superfície devidamente desinfestada, foi cultivada em frascos Erlenmeyer de 125 mL, com 50 mL de volume de trabalho, em meio mineral suplementado com extrato de levedura 0,06% (p/v), com diferentes fontes de carbono, sempre a 0,3% (p/v) e pH 7,0, sendo a cultura incubada a 25 oC, com agitação de 150 rpm ou sem agitação. A bactéria também apresentou crescimento quando o extrato de levedura foi substituído por tiamina 50 mg L'1 e outras vitaminas do complexo B, mas nunca quando alguns desses fatores não eram adicionados ao meio mineral. Paenibacillus amylolyticus cresce na ausência de sulfato de amônio, desde que extrato de levedura 0,06% (p/v) esteja presente, porém o mesmo não se verifica quando se substitui o extrato de levedura por tiamina 50 mg L'l. O microrganismo não foi capaz de crescer em anaerobiose provocada pelo borbulhamento de nitrogênio gasoso, tanto na presença quanto na ausência de sulfato de amônio, indicando que tal bactéria não é capaz de crescer em anaerobiose e fixar nitrogênio nessa condição. P. amylolyticus é capaz de crescer em pectina como única fonte de carbono e, para tal, produz pectina liase (PL), para lise deste carboidrato. A enzima PL acumula- se no meio mais eficientemente após 24 horas de crescimento, apresentando maior especificidade por pectina cítrica, quando utilizada como substrato enzimático. A atividade ótima de PL ocorre a 40 ºC e a termoestabilidade, até 45 ºC. Entre os valores de pH avaliados, PL apresentou atividade entre pH 5,6 e 8,6, sendo o ótimo 7,9. A adição de EDTA e íons metálicos na mistura de reação mostrou pequeno efeito na atividade da enzima, e os valores de Km e Vmax aparentes foram, respectivamente, de 6,61 mg mL'1 e 1,24 X 10'7 mol min 4 mL'l.Item Organização e regulação de genes que codificam poligalacturonases em Penicillium griseoroseum(Universidade Federal de Viçosa, 2001-09-06) Ribon, Andréa de Oliveira Barros; Araújo, Elza Fernandes de; http://lattes.cnpq.br/4593565738644641Os genes Penicillium região pgg1 e pgg2, griseoroseum, codificadora do que codificam poligalacturonases foram clonados e gene pgg1 possui caracterizados. 1251 pares de em A bases (pb) e é interrompida por íntrons de 55 e 67 pb, posicionados por comparação com a seqüência do cDNA correspondente. Uma proteína de 376 aminoácidos (aas) foi obtida da tradução deste gene com e apresenta massa um molecular potencial e pI sítio estimados de em glicosilação 38,4 KDa (Asn 307 ), e 5,31, respectivamente. O gene pgg2, de 1165 pb, também é interrompido por dois íntrons de 58 pb. Os íntrons de pgg1 e pgg2 apresentam posições conservadas, embora o mesmo não tenha sido verificado com as suas seqüências. A proteína deduzida de pgg2 possui 369 aas, massa molecular 38,3 KDa, pI 8,31 e dois possíveis sítios de (Asn 300 glicosilação Asn 338 ). e A identidade entre as proteínas PGG1 e PGG2 foi de 57,5%. Análise mostrou por que hibridização do genes e os únicas no genoma gênero Penicillium pgg1 do fungo. foram DNA total de pgg2 estão Diferentes investigadas P. griseoroseum presentes espécies quanto em de à cópias fungos do presença de genes de PG em seu genoma. Os resultados revelaram que a essas espécies contêm PGs codificadas por poucos genes, ao contrário do observado possuem em Aspergillus famílias de genes niger de PG e Botrytis constituídas cinerea, por no que mínimo cinco membros. A expressão dos genes pgg1 e pgg2 foi analisada por hibridização do RNA total e pela técnica de RT-PCR. Ambos os genes são transcricionalmente regulados, porém com expressão diferenciada entre si. A expressão do gene pgg1 foi verificada apenas em 76 horas de cultivo do micélio em meio com pectina suplementado com extrato de levedura, enquanto o transcrito do gene pgg2 expressão fontes não foi de de com detectado ambos os carbono, em todos genes como também sacarose extrato de levedura. detectados apenas na presença adição extrato de levedura. pgg2 de os e tempos foi de analisada glicose, de pectina, Contudo, a em pgg1 ou foram independente expressão A outras suplementadas Transcritos de cultivo. do da gene foi reprimida somente em meio contendo glicose. A adição de extrato de levedura ao meio de cultivo contendo glicose teve um efeito positivo sobre a expressão de pgg2, embora um nível maior de expressão tenha sido verificado na presença de sacarose e pectina. As regiões 5’ terminais dos genes pgg1 e pgg2 foram sequenciadas para caracterizar cis-elementos e analisar a interação com proteínas reguladoras. Ensaios de migração retardada em gel foram realizadas para comprovar a funcionalidade de alguns cis-elementos. Extratos a a protéicos nucleares foram diferentes proteína preparados fontes foi reguladora de carbono. visualizada do gene de quando pgg2 micélio A crescido em meio formação de complexos fragmentos de DNA contendo os cis-elementos da com DNA- região CCAAT e TATAATTAA foram utilizados. Um possível elemento de resposta ao cAMP foi localizado na posição -757. A região reguladora do gene pgg1 possui um potencial sítio de ligação para o regulador geral CREA sobreposto ao TATA “box”, o que pode ser uma explicação para a ausência de expressão deste gene na presença de glicose.Item Atividade de β-galactosidase em Kluyveromyces marxianus var. lactis na fase de desaceleração do crescimento em soro de queijo ultrafiltrado(Universidade Federal de Viçosa, 2001-09-05) Ornelas, Ana Paula Rodrigues de Castro; Passos, Flávia Maria Lopes; http://lattes.cnpq.br/0051364351663555A levedura Kluyveromyces marxianus var. lactis (K. lactis) foi cultivada em soro de queijo ultrafiltrado (SUF) em regimes de batelada e contínuo com o objetivo de investigar as condições fisiológicas que levam ao aumento e à queda da atividade de β-galactosidase na entrada da fase de desaceleração do crescimento. As fases fisiológicas do crescimento no cultivo em batelada foram caracterizadas, e observou-se que as concentrações iniciais de células de DO 600 0,1, 0,2 e 0,3 afetam a velocidade de crescimento, porém a delimitação das fases de crescimento é semelhante. A fase estacionária do crescimento foi apenas iniciada em 144 horas, o que permitiu uma longa fase de desaceleração do crescimento. O aumento e a queda na atividade de β-galactosidase foram acompanhados durante os cultivos, assim como a utilização de lactose e a formação e o consumo de etanol, além do perfil eletroforético da β- galactosidase intra e extracelular. Os picos de atividade máxima da enzima foram encontrados no final da fase log e no início da fase de desaceleração nas culturas conduzidas em regime de batelada e no cultivo contínuo na taxa de diluição de 0,09 h^-1. Nessas condições, as concentrações de lactose no meio não se correlacionaram com o máximo de atividade da enzima. Após a queda da atividade máxima, havia ainda lactose no meio e o etanol em concentrações crescentes. Desta forma, a queda na atividade não está relacionada com a exaustão de lactose no meio, nem com o crescimento diáuxico à custa do etanol, embora durante a fase de desaceleração do crescimento tenha sido observada diauxia quando a concentração de lactose era limitante. Outros picos de atividade foram evidenciados antes e após o pico máximo, onde foram obtidos os mesmos resultados. A β-galactosidase das amostras das culturas em batelada e contínua foi analisada em gel de poliacrilamida desnaturante e indicou a inexistência de uma relação direta entre a atividade da enzima e a concentração da proteína, com exceção nos tempos em que a atividade é máxima, quando houve aumento da intensidade da banda protéica no gel. Nas amostras de sobrenadante de ambas as bateladas e da cultura contínua submetidas à análise em gel, não se encontrou β-galactosidase, indicando que o etanol produzido não permeabilizou K. lactis. Cerca de 55 a 69% da lactose em ambos regimes de cultivo, foram convertidos em etanol. E, a variação cíclica da cinética de atividade durante o cultivo em regime de batelada e regime contínuo pode ser explicada pelos eventos de regulação da síntese e da atividade de β-galactosidase.Item Atividades das enzimas de assimilação de nitrogênio em mudas de eucalipto com ectomicorrizas(Universidade Federal de Viçosa, 2001-10-09) Chiquete, Adalberto Antônio Sukumula; Kasuya, Maria Catarina Megumi; http://lattes.cnpq.br/3618761311154205A atividade de glutamato desidrogenase (GDH), glutamina sintetase (GS) e glutamtato sintase (GOGAT) foi determinada em três isolados dos fungos ectomicorrízicos Pisolithus sp. (PT90A e RV82) e Laccaria laccata (ME46), crescidos por 25 dias na presença 2,26 mmol L^-1 de N-NH4^+, N-NO3^- ou N-NH4^+/N-NO3^- (1:1). A atividade de todas as enzimas variou entre os isolados e também com a fonte de nitrogênio utilizada no meio de crescimento. Em geral, os maiores valores de atividade foram observados no micélio do isolado RV82 Pisolithus sp. Este isolado também produziu maior quantidade de proteína. Não foi observado crescimento micelial do isolado ME46 quando cultivado em meio contendo N-NO3^- como única fonte de nitrogênio. Foi também estudado, em tubetes com 50 cm³ de areia, o efeito de N-NO3^-, N-NH4^+ ou N-NH4^+/NO3^- (1:1), nas doses de 50, 75, 100 ou 200 mg Kg^-1, sobre a colonização micorrízica, a produção e composição mineral da matéria seca, bem como as atividades das enzimas de assimilação de nitrogênio redutase do nitrato (RN), GDH, GS e GOGAT, em mudas de E. grandis inoculadas com os isolados acima. A atividade das enzimas de assimilação do nitrogênio na planta variou de acordo com a fonte e a dose de N aplicada e o fungo inoculado. Em geral, a atividade das enzimas na parte aérea das plantas foi maior do que na raiz, observando-se sempre maior atividade nas plantas inoculadas em relação às não inoculadas. No sistema radicular de plantas inoculadas com o ME46 e no das não-inoculadas não foi detectada atividade de RN e GDH. A produção de matéria seca e o conteúdo de nutrientes foi maior nas plantas inoculadas em relação às não-inoculadas.Concluiu-se que associação ectomicorrízica influencia a eficiência de utilização de diferentes formas de N pelas plantas, por alterar a atividade das enzimas de assimilação desse elemento.Item Isolamento e caracterização do gene que codifica nitrato redutase em Penicillium expansum(Universidade Federal de Viçosa, 2001-02-05) Torres, Adalgisa Ribeiro; Queiroz, Marisa Vieira de; http://lattes.cnpq.br/2275715255949627O gene que codifica nitrato redutase em Penicillium expansum foi isolado de um banco genômico construído no vetor fago lambda EMBL3. Um fragmento de DNA de 3,17 Kb, contendo parte da região codificadora do gene da nitrato redutase de Penicillium chrysogenum, foi utilizado como sonda. Quatro fagos recombinantes foram isolados e denominados λPENR1, λPENR3, λPENR5 e λPENR6, com fragmentos de DNA clonados de 14,4; 14,4; 12,3 e 12,6 Kb, respectivamente. A análise por hibridização do DNA dos fagos recombinantes, clivado com Sal I, identificou fragmentos cujos tamanhos correspondiam a 4,7 Kb (λPENR1), 6,0 Kb (λPENR3), 8,4 Kb (λPENR5) e 7,6 Kb (λPENR6). Para a construção do mapa físico de restrição do fago recombinante λPENR3, foram feitas clivagens simples e duplas com enzimas de restrição. A análise de restrição e hibridização dos fragmentos de DNA do fago recombinante λPENR3 revelou que o gene nia estava presente em um fragmento de 6,5 Kb. Este fragmento foi subclonado no plasmídeo pBluescript SK+, e o plasmídeo recombinante foi denominado pPENR. Para a construção do mapa físico de restrição de pPENR, foram feitas clivagens simples e duplas com enzimas de restrição. O plasmídeo recombinante pPENR foi utilizado na transformação dos mutantes Nia^- de P. expansum e Penicillium griseoroseum, sendo obtida uma freqüência de 16 transformantes por μg de DNA.