Microbiologia Agrícola
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Item Ethanol stress responses of Kluyveromyces marxianus CCT 7735 revealed by proteomics and metabolomics analyses(Universidade Federal de Viçosa, 2017-05-30) Alvim, Mariana Caroline Tocantins; Silveira, Wendel Batista da Silveira; http://lattes.cnpq.br/7578520372524430Non-Saccharomyces yeasts, such as Kluyveromyces marxianus, have called attention as promising strains for bioethanol production. K. marxianus displays desirable physiological characteristics for bioethanol production, such as capacity to assimilate pentoses and disaccharides beyond sucrose – present in the agro- industrial and forest residues – and thermotolerance. However, K. marxianus, contrary to Saccharomyces cerevisiae, is not tolerant to high ethanol concentrations. Moreover, its physiological responses to ethanol are not well elucidated; therefore, characterizing its physiological responses under ethanol stress is pivotal to apply this knowledge into metabolic engineering approaches to construct strains tolerant to ethanol. Thus, the aim of this work was to determine the ethanol responses of K. marxianus CCT 7735 subjected to 1 and 4 h of ethanol stress through both protein and metabolic profiles. It was observed that at 1 h of stress, although glycolytic enzymes and alcohol dehydrogenases were more abundant lactose and ethanol are not consumed by the yeast. On the other hand, at 4 h the abundance of proteins involved in carbon pathways and protein translation was reduced. In addition, there was an increase in the abundance of proteins and metabolites related to the response to oxidative and osmotic stresses, as well as to heat shock proteins. Interestingly, at 1 h of exposure to ethanol, plasma membrane ATPase was highly abundant, likely to counteract the proton motive force dissipation, which is related to the influx of protons due to increased permeability caused by ethanol. However, at 1 and 4 h of stress, respectively, the level of the metabolites trehalose, ergosterol and some amino acids reduced. Therefore, the results obtained in this study provide important information to improve the understanding of the ethanol responses displayed by K. marxianus.Item Condições fisiológicas que favorecem a síntese de ácido L-ascórbico (vitamina C) por culturas de Kluyveromyces lactis metabolicamente engenheirada(Universidade Federal de Viçosa, 2014-02-17) Alvim, Mariana Caroline Tocantins; Passos, Frederico José Vieira; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781218J9; Silveira, Wendel Batista da; http://lattes.cnpq.br/7361036485940798; Passos, Flávia Maria Lopes; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781817D3; http://lattes.cnpq.br/7578520372524430; Rosa, Júlio César Câmara; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4716126E0O ácido L-ascórbico (ALA) é produzido naturalmente por plantas a partir de D-glicose. Leveduras sintetizam um metabólito semelhante, o ácido D-eritroascórbico (ADEA). Embora este composto não mostre atividade contra o escorbuto, ele contém uma função antioxidante, mas é produzido pelo micro-organismo em baixas concentrações. Recentemente, com a finalidade de fazer as leveduras serem capazes de converter o componente D-galactose da D-lactose do soro de queijo em ALA, a linhagem selvagem de Kluyveromyces lactis CBS2359 foi transformada com genes, que integram a via de biossíntese de L-galactose, isolados de Arabidopsis thaliana. Na presença do intermediário L-galactose, ALA pode então ser sintetizado pela levedura com as enzimas responsáveis pela produção de ADEA. Foi demonstrado que a linhagem engenheirada JVC 1-56 foi capaz de sintetizar ALA em comparação com a selvagem, mas com baixo rendimento. Neste sentido, estudos que auxiliem o aumento da produção de ALA são relevantes. Uma vez que a via engenheirada da síntese de ALA e a via nativa da formação da parede celular de K. lactis possuem um intermediário comum, GDP-D-manose, faz-se necessário avaliar o efeito do desacoplamento da produção de ALA do crescimento que requer constante síntese da parede. Além disso, considerando a propriedade antioxidante do ALA, a expectativa é de que a produção deste metabólito aumentasse quando JVC 1-56 fosse exposta a uma condição de estresse oxidativo por menadiona. Neste contexto, este trabalho investigou as condições fisiológicas mencionadas utilizando os meios Yeast Galactose Base (YGB) e soro de queijo ultrafiltrado (SQU - subproduto de indústrias de queijo em que predomina lactose como fonte de carbono). Foi averiguado que Kluyveromyces lactis JVC 1-56 produz ALA com rendimentos maiores quando cultivada por 96 horas em batelada no meio YPGal. O cultivo em baixas velocidades de crescimento (0,04 h -1) predispõe as células a sintetizar mais ALA por unidade de massa celular (0,80 mg/mg). Entretanto, o rendimento da cultura contínua operada como quimostato, tendo nitrogênio como substrato limitante, ainda mostrou ser inferior ao previsto na batelada (1,94 mg/mg). Já o estresse oxidativo por 12,5 μM de menadiona sobre K. lactis JVC1- 56, nas condições aplicadas, não foi eficaz no aumento da produção de ALA (1,47 mg/mg). Ainda, o rendimento de ADEA foi superior ao de ALA nas duas estratégias: 1,37 mg/mg a 0,21 h-1 na cultura sob regime permanente, 8,52 mg/mg na batelada sob estresse oxidativo e 10,33 mg/mg na batelada na ausência do agente oxidante, indicando que ele pode estar em uma configuração mais estável do que a vitamina C. Finalmente, o permeado do soro de queijo continua sendo uma perspectiva para a conversão da lactose em um produto biotecnológico de maior valor agregado.