Microbiologia Agrícola
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Item Hidrofobicidade celular e biossurfactantes como determinantes da capacidade desemulsificante de isolados bacterianos(Universidade Federal de Viçosa, 2011-03-31) Fernandes, Rita de Cássia Rocha; Borges, Arnaldo Chaer; http://lattes.cnpq.br/1404894439547309A capacidade de culturas microbianas de desestabilizarem emulsões do tipo óleo em água (O/W) ou água em óleo (W/O), promovendo a separação de fases, é frequentemente atribuída a características como hidrofobicidade da superfície celular e a capacidade de produção de compostos com atividade surfactante e ação desemulsificante. Neste trabalho, foi avaliada a hipótese de que a capacidade de quebra de emulsões O/W ou W/O de isolados bacterianos está relacionada à hidrofobicidade celular e à produção de biossurfactantes com ação desemulsificante. As bactérias com capacidade desemulsificante foram isoladas a partir de composto de resíduo sólido urbano contaminado com óleo diesel, após enriquecimento em meio mineral contendo parafina líquida como fonte de carbono (MMSM-parafina). O agrupamento gerado com base no perfil de ácidos graxos dos 23 isolados obtidos distinguiu a presença de doze linhagens bacterianas, das quais quatro foram eficientes para quebra de emulsão W/O, sendo a razão de quebra de emulsão maior que 70%. Essas bactérias foram identificadas como Acinetobacter sp. (LBBMA LU3 e LBBMA 7a) e Pseudomonas mendocina (LBBMA LU5b e LBBMA LU7b). Nenhuma delas produziu biossurfactantes ou foi capaz de quebrar emulsão do tipo O/W. Os dados demonstram que a produção de biossurfactantes não é requerida para promover a quebra de emulsões W/O; contudo, indicam que esses compostos podem ser requeridos para a quebra de emulsões do tipo O/W. A capacidade de quebra de emulsão W/O diminuiu com o tempo de crescimento das culturas e foi dependente da presença de células com até 22 horas de cultivo em meio MMSM-parafina, não havendo influência de componentes do sobrenadante. Ao contrário, a atividade desemulsificante de culturas mais velhas e, em especial, a capacidade de separar a fase oleosa contida nas emulsões, foram atribuídas à presença de compostos desemulsificantes sem atividade surfactante. A atividade desemulsificante de Acinetobacter sp. LBBMA LU3 aumentou linearmente com o aumento da temperatura, não sendo afetada por salinidade (até 150 g L-1) ou pelo pH (3-8). Em algumas linhagens, foi observada a existência de uma possível interação entre células sedimentáveis e não-sedimentáveis numa mesma cultura, a qual determina a sua atividade desemulsificante. Na literatura especializada, não se encontra registro desse tipo de interação entre células distintas de uma mesma cultura bacteriana, em relação à sua atividade de quebra de emulsão W/O. Também, o efeito negativo de células não-sedimentáveis de algumas linhagens bacterianas sobre a separação da fase oleosa em emulsão W/O representa conhecimento novo para a área. A integridade das células de Acinetobacter sp. LBBMA LU3 não é necessária para a atividade desemulsificante. A utilização de células de uma mesma linhagem bacteriana com diferentes valores de hidrofobicidade de superfície celular, obtidas durante a desnutrição em meio com carência de nitrogênio, revelou que inexiste uma relação única entre hidrofobicidade celular e capacidade de quebra de emulsão W/O. A hidrofobicidade celular correlaciona-se tanto positiva como negativamente com a capacidade de quebra de emulsão W/O e com a capacidade de separação de querosene contido na emulsão. Conclui-se, portanto, que outras características da superfície celular bacteriana, e não a sua hidrofobicidade, são determinantes para a sua atividade desemulsificante.Item Solubilização de fosfatos de rocha por Penicillium islandicum(Universidade Federal de Viçosa, 2018-02-23) Bonduki, Victor Hugo Araújo; Costa, Maurício Dutra; http://lattes.cnpq.br/0594143652004072O consumo de fertilizantes minerais aumenta anualmente com vistas a melhorar a produtividade das lavouras. Os fertilizantes fosfatados estão entre os mais comercializados em razão da importância do fósforo (P) para o crescimento, o desenvolvimento e a produção vegetal em solos empobrecidos desse nutriente. Nos solos brasileiros, a disponibilidade de P é baixa e, na maioria das vezes, o elemento torna-se inacessível às raízes em face de sua retenção nos minerais de argila. Para contornar esse problema, o uso de fontes alternativas de P em substituição aos fertilizantes solúveis dispendiosos têm sido estudadas. Para suprir a demanda de mercado, os fosfatos naturais ou de rocha (FRs), fontes de P, são tratados por processos químicos e térmicos de elevado custo energético que causam poluição. Os FRs brasileiros são de baixa reatividade, fazendo com que o seu processamento seja mais oneroso. Esse fato desestimula o uso de reservas de rocha fosfáticas nacionais, levando à importação de FRs estrangeiros de maior reatividade. Uma alternativa viável para o uso de FRs brasileiros é a utilização de microrganismos com capacidade de solubilizar esse material por meio de processos biológicos de acidificação do meio e complexação de cátions. A solubilização microbiana tem também a vantagem de permitir a utilização de substratos sólidos para o crescimento microbiano, geralmente rejeitos ou resíduos da indústria agrícola. O objetivo do presente trabalho foi o de estudar a solubilização microbiana de FRs por P. islandicum FS41 em meios líquidos e em sistema de fermentação em substrato sólido com bagaço de cana-de-açúcar. A capacidade fúngica de solubilizar os FRs de Araxá, Catalão, Patos de Minas, Bayóvar e Argélia foi testada neste trabalho. O P. islandicum FS41 imobilizou o P liberado em meio Strasser, em fermentação em substrato sólido, quando na presença dos FRs de Araxá, Catalão e Patos de Minas. Os FRs Argélia e Bayóvar apresentaram valores baixos de P em solução, correspondendo a 18,9 e 9,8 mg L-1, respectivamente. A diminuição da disponibilidade de nitrogênio, atrelada à utilização de fontes amoniacais no meio Strasser, no sistema de fermentação em substrato sólido, promoveu aumentos do P em solução para os FRs Argélia, Bayóvar, Patos de Minas e Araxá. A ausência de fontes nitrogenadas ixinorgânicas e de extrato de levedura, no meio Strasser e no mesmo sistema de fermentação, favoreceu a liberação de P a partir do FR de Araxá, com valor de P em solução de 47,9 mg L-1 ou cerca de 11 % de solubilização. A solubilização dos FRs por P. islandicum FS41 foi mais eficiente em meio NBRIP do que no meio Strasser em sistema de cultivo em batelada em meio líquido, com valores médios de P em solução de 96,7, 79,7, 26,9, 23,2 e 22,3 mg L-1 para os FRs Argélia, Bayóvar, Patos de Minas, Catalão e Araxá, respectivamente. Alternativamente, o pré-cultivo de P. islandicum FS41 e a posterior transferência da biomassa micelial produzida para meio de solubilização com baixa disponibilidade de nutrientes minerais resultou em valores de P em solução de 130 mg L-1, o que correspondeu a 30 % de solubilização do P contido no FR de Araxá. Essa última estratégia promoveu aumentos de 2,71 a 5,8 vezes do P em solução em comparação aos valores obtidos nos experimentos anteriores. Diferentemente de outros fungos solubilizadores de fosfato, P. islandicum FS41 mostrou-se mais eficiente na produção de biomassa micelial, com forte tendência de imobilização do P liberado dos FRs. O presente trabalho aponta algumas alternativas de se contornar esse problema. No entanto, esforços adicionais deverão ser conduzidos para a otimização do processo de solubilização de FRs por esse fungo.Item Sistemas de recuperação de ribossomos em Actinobacillus pleuropneumoniae: papel em virulência e resposta a diferentes condições de estresse(Universidade Federal de Viçosa, 2018-07-27) Teixeira, Ana Carolina Nery; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://lattes.cnpq.br/1967721199398909A pleuropneumonia suína é uma doença respiratória causada pelo patógeno bacteriano Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) cujo sucesso na colonização e permanência nos pulmões do suíno está relacionado à sua capacidade de resistência a diferentes condições de estresse e a inúmeros fatores de virulência. Para o sucesso do patógeno, a síntese proteica eficiente é um gargalo, uma vez que este processo pode ser um fator limitante durante o crescimento e replicação bacterianos, e para isso há uma expressiva necessidade de ribossomos ativos dentro da célula. Em condições de estresse, os ribossomos podem ficar parados em uma fita de mRNA quando um códon de parada não é detectado, precisando, portanto, de um resgate ativo em um processo chamado trans-tradução. Um RNA pequeno denominado tmRNA, ubíquo em bactérias, codificado pelo gene ssrA, é responsável por mediar o mecanismo de trans-tradução. Muitas bactérias ainda apresentam dois sistemas adicionais mediados pelo fator de resgate alternativo A (alternative rescue factor A), ArfA, descrito em outras bactérias como Escherichia coli, Salmonella enterica e Yersinia pestis e o fator de recuperação alternativo B (alternative rescue factor B), ArfB presente em 34% dos genomas bacterianos já sequenciados. Este trabalho teve como objetivos investigar qual(is) sistema(s) de recuperação de ribossomos está(ão) presente(s) em A. pleuropneumoniae e qual o envolvimento deste(s) na virulência e na resposta a diferentes condições de estresse. Análises in silico e in vitro foram conduzidas com este propósito. Nossos resultados in silico mostraram que A. pleuropneumoniae possui apenas dois sistemas de recuperação de ribossomos, e o fato de não conseguirmos a obtenção de uma linhagem duplo mutante (∆ssrA_∆arfA) valida nosso resultado. Para verificar o envolvimento destes genes em virulência e resposta a condições de estresse, linhagens mutantes denominadas ∆ssrA e ∆arfA, bem como linhagens complementadas para as respectivas linhagens, ∆ssrAC e ∆arfAC, respectivamente, foram construídas a partir da linhagem APP MIDG2331 WT (sorotipo 8). Estas linhagens (WT, mutantes e complementadas) foram investigadas quanto ao crescimento in vitro, adesão, sensibilidade a antibióticos e a diferentes condições de estresse (oxidativo, osmótico, temperatura e etanólico). Além disso, a virulência destas linhagens foi analisada no modelo de infecção alternativo Galleria mellonella. Análises fenotípicas mostraram que o mutante ∆ssrA foi mais sensível antibióticos e a todas as condições de estresse se comparado à linhagem WT e ao mutante ∆arfA. Além disso, o mutante ∆ssrA apresentou menor capacidade de adesão e virulência atenuada em G. mellonella quando comparada com as linhagens WT e ∆arfA. A linhagem ∆ssrAC não mostrou uma restauração completa do fenótipo original. Entretanto, a linhagem ∆arfAC mostra uma restauração completa do fenótipo. Estes resultados mostram que o gene ssrA tem um papel importante na resistência ao estresse e na virulência em APP e a ausência do gene arfA não afetou o fitness da bactéria nas condições avaliadas. Diante desses resultados, podemos concluir que o sistema TmRNA/SmpB é o principal sistema de recuperação de ribossomos em A. pleuropneumoniae e que a falta do mesmo acarreta em atenuação do fenótipo de virulência e aumento da sensibilidade a condições de estresse.Item Biossurfactantes e Polímeros de Bacillus subtilis RI4914 e sua Aplicação em Recuperação Avançada de Petróleo(Universidade Federal de Viçosa, 2011-09-01) Fernandes, Péricles Leonardo; Tótola, Marcos Rogério; 9781385135118198Neste trabalho foram realizados experimentos com o intuito de avaliar-se a propriedade dos biossurfactantes produzidos pelo isolado Bacillus subtilis RI4914 em reduzir a tensão interfacial e promover a recuperação de óleo residual em colunas empacotas com areia. Foi observado que a solução de biossurfactantes é capaz de mobilizar até 40% do óleo residual das colunas, porém somente em concentrações elevadas (2,0 g L-1). Por outro lado, a utilização do sobrenadante da cultura do isolado RI4914 proporcionou recuperação de óleo superior à alcançada com a solução dos biossurfactantes e em concentração dez vezes menor da molécula. Tais resultados indicam a produção de compostos capazes de atuar sinergisticamente com os biossurfactantes na redução da tensão interfacial, alcançando valores de até 0,07 mN/m. Além disso, destaca- se a produção espontânea de polímero pela bactéria, molécula esta capaz de aumentar a viscosidade do sobrenadante e reduzir quase que pela metade o volume necessário para uma recuperação satisfatória de óleo residual. Os biossurfactantes apresentaram características físico-químicas comparáveis às do surfactante sintético SDS. Em termos de estabilidade, as moléculas demonstraram ter sua atividade pouco influenciada por condições extremas, principalmente no que se diz respeito às altas temperaturas. Esses resultados foram comprovados quando o sobrenadante da cultura foi avaliado quanto a sua capacidade em promover a recuperação do petróleo residual em salinidades variando entre 3 e 10% (p/v) de NaCl e em uma faixa de pH de 6,0 a 9,0. A recuperação de óleo pelo sobrenadante da cultura demonstrou ser também pouco influenciada pelas condições ambientais testadas, chegando a recuperar 88% do petróleo residual na presença de polímero. Esses resultados comprovam que os biossurfactantes descritos neste trabalho são substitutos em potencial para os surfactantes sintéticos frequentemente utilizados na indústria do petróleo.Item Morfologia celular, perfil de ácidos graxos e ativação de macrófagos por Salmonella enterica sorovar Enteritidis no estado viável não cultivável(Universidade Federal de Viçosa, 2012-03-13) Carmo, Camila Pinheiro; Santos, Míriam Teresinha dos; 1076507388602401O patógeno de origem alimentar, Salmonella spp. é capaz de entrar no estado viável não cultivável (VNC) em resposta a condições ambientais adversas. A presença de células VNC é um problema de saúde pública, uma vez que as células neste estado não são detectadas pelas metodologias tradicionais utilizadas de rotina em laboratórios, resultando em avaliação inadequada de alimentos contaminados com patógenos. Os objetivos desse trabalho foram caracterizar o gene ssaB do isolado Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Enteritidis PT4, avaliar a ativação de macrófagos e as alterações do envelope celular por microscopia de força atômica e por meio do perfil de ácidos graxos desta estirpe no estado VNC. O gene ssaB apresentou alta identidade entre os demais sorovares avaliados e o produto do gene apresentou similaridade com outras espécies de bactérias patogênicas. Por análise filogenética da sequência de aminoácidos, foi possível observar que a estirpe em estudo ficou próxima a outros sorovares de S. enterica subsp. enterica, incluindo linhagens do sorovar Enteritidis e distante de S. enterica subsp. arizonae e de outras espécies da família Enterobactericeae. Os macrófagos foram ativados em contato com células VNC de Salmonella, porém as células neste estado foram incapazes de impedir ou diminuir a produção de H2O2 pelos macrófagos como as células em fase logarítmica. As células de Salmonella Enteritidis no estado VNC apresentaram perfil de ácidos graxos diferente das células em condição ótima de crescimento e similar ao perfil de células submetidas ao estresse frio, porém o perfil das células VNC não apresentou alteração com o aumento do tempo de permanência nesta condição. Samonella Enteritidis no estado VNC apresentou redução nas dimensões celulares (área, volume, perímetro, comprimento e diâmetro) e transição da forma bacilar para a forma cocóide. Neste trabalho conclui-se que a morfologia celular e o perfil de ácidos graxos de Salmonella Enteritidis PT4 no estado VNC são diferentes dos de células na fase exponencial e nossos resultados sugerem que Salmonella Enteritidis no estado VNC apresenta uma menor virulência devido ao impedimento da produção de H2O2 por macrófagos.Item Inibição das atividades proteolítica e lipolítica de Pseudomonas fluorescens por nisina.(Universidade Federal de Viçosa, 2018-07-31) Ribeiro, Leandro Cardoso; Vanetti, Maria Cristina Dantas; 6601616143350350A atividade destas enzimas sobre os constituintes do leite causa diversos problemas como a gelificação e coagulação, sabor e odor indesejados além de rancidez, levando à diminuição do rendimento na fabricação de queijos, perda de qualidade sensorial e diminuição da vida de prateleira dos produtos lácteos. Nisina é uma bacteriocina produzida por Lactococcus lactis utilizada como bioconservante em alimentos em mais de 50 países. Tem ação bactericida contra micro-organismos gram-positivos por se ligar à membrana citoplasmática destes, formar poros que ocasionam o efluxo de eletrólitos e de metabólitos, levando o micro-organismo à morte. Entretanto, micro-organismos gram- negativos são pouco susceptíveis ao mecanismo de ação da nisina, uma vez que a membrana externa atua como barreira, impedindo a passagem da bacteriocina, não permitindo que esta chegue ao seu sítio de ação. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito inibitório de nisina sobre a atividade das proteases e lipases produzidas por Pseudomonas fluorescens, quantificar as atividades proteolíticas e lipolíticas extra e intracelular na presença e na ausência de nisina e verificar a influência da bacteriocina sobre a transcrição dos genes do operon aprX-lipA. Foi observado que nisina, na concentração de 400 AU/mL não inibe o crescimento celular de P. fluorescens mas, tem efeito inibitório sobre as atividades proteolítica e lipolítica desta bactéria. A atividade proteolítica dos isolados de P. fluorescens denominados L211, L213 e L214 foi inibida em 78, 90 e 92%, respectivamente, no período de 24 h na presença de nisina. Este efeito inibidor foi reduzido no período de 48 h de incubação e variou entre 58% e 60%. A atividade lipolítica dos isolados de P. fluorescens L211 e L213 foi completamente inibida em 24 h de incubação, enquanto o percentual de inibição da atividade lipolítica do isolado L214 foi de 97%. Como observado sobre a atividade proteolítica, a extensão do período de incubação para 48 h reduziu o efeito inibidor da nisina sobre a lipólise e este percentual de inibição variou de 89% à 92%. Não foi observada nenhuma influência da nisina sobre a reação hidrolítica das enzimas secretadas. Porém, não foi possível esclarecer se nisina atua sobre a transcrição dos genes, a síntese ou sobre a secreção da protease e da lipase do micro-organismo. A extração do RNA total foi feita para investigar a transcrição dos genes aprX, lipA, aprD, aprE e aprF, referentes à protease, lipase e as três proteínas do sistema de transporte ABC, respectivamente, em condições de crescimento de P. fluorescens na presença de nisina (400 AU/mL). Estas análises podem ajudar a explicar o mecanismo utilizado por nisina para inibir a atividade enzimática de P. fluorescens.Item Solubilização de fosfato de rocha e dessorção de fósforo no solo por ácidos orgânicos e Aspergillus niger(Universidade Federal de Viçosa, 2018-07-19) Nascimento, Jaqueline Maria; Costa, Maurício Dutra; 5286287099001962O fósforo (P) pode sofrer reações de adsorção, precipitação e imobilização no solo que diminuem a disponibilidade desse nutriente para as plantas. Ao ser fixado a óxidos e hidróxidos de ferro e alumínio, o P passa a compor a fase sólida do solo, sendo de difícil disponibilização para as culturas. Alguns compostos, a exemplo dos ácidos orgânicos, apresentam a capacidade de extrair P de rochas fosfáticas de baixa reatividade. Esses compostos podem ser produzidos por plantas e microrganismos como estratégia para aquisição de P para o crescimento. Pouco se conhece sobre a cinética de solubilização de fosfato de rocha de Araxá por ação de ácidos orgânicos e ainda, sobre a capacidade desses ácidos orgânicos e de microrganismos solubilizadores em disponibilizar o P adsorvido ao solo. Os objetivos desse trabalho foram estudar a cinética de solubilização de fosfato de Araxá por ácidos orgânicos e avaliar a capacidade desses compostos, bem como a de Aspergillus niger, de dessorver P a partir de fração de 75-µm de um Oxissol. A cinética de solubilização de fosfato de Araxá foi realizada utilizando-se a técnica de stirred-flow, com soluções de ácido oxálico, cítrico e glicônico 5 ou 10 mmol L-1 e suas combinações aos pares na concentração final de 10 mmol L-1 (5 mmol L-1 para cada componente). As amostras foram coletadas durante 150 min em fluxo contínuo de 1 mL min-1 e o P analisado por colorimetria. As partículas de fosfato de Araxá residuais foram analisadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e a composição mineralógica determinada por difração de raio-X (DRX). A cinética de dessorção de P da fração de 75-µm dos horizontes A e B do LVA foi realizada após incubação por um e 40 dias de contato de P com a fração do solo. A quantidade de P adsorvida ao solo correspondeu a 90 % da capacidade máxima de adsorção de P (CMAP). As soluções extratoras utilizadas foram ácido oxálico, ácido oxálico + cítrico na concentrações 10 mmol L-1, além de água a pH 2,0 e 7,0. Testou-se também a capacidade de A. niger em dessorver P das frações do solo em meio de cultura. O ácido oxálico a 10 mmol L-1 foi o composto mais eficiente na solubilização de fosfato de Araxá. Ao final do experimento, 43 % do P contido no fosfato de Araxá havia sido solubilizado. A eficiência do ácido oxálico foi aumentada quando combinado com ácido cítrico, a 10 mmol L-1. O processo de solubilização de fosfato apresentou porcentagens de solubilização de P de 71 %. As partículas de fosfato de Araxá sofrem alterações na morfologia e mineralogia quando em contato com ácidos cítrico e oxálico e com a combinação dos dois. O ácido oxálico reduziu fortemente o conteúdo de apatitas do fosfato de Araxá, destacando principalmente a redução no conteúdo de flourapatita. Nos tratamentos com ácido oxálico, observou-se a formação de oxalato de cálcio. O ácido oxálico foi ainda o mais eficiente, dentre os ácidos orgânicos avaliados, em dessorver P do solo. Para o horizonte A, nos tempos de 24 e 960 h de incubação de P com o solo, o ácido oxálico atingiu valores de 35.5 e 32.7 % de P liberado em solução. Para o horizonte B, para os tempos de 24 e 960 h, o P liberado em solução atingiu valores de 22.4 e 18.5 %, respectivamente. Quando na presença de A. niger, os valores de dessorção de P foram de 23 e 18 %, no horizonte A, e de 17 e 18 %, no horizonte B, nos tempos de 24 e 960 horas, respectivamente. O ácido oxálico foi o metabólito testado mais eficiente na solubilização de P a partir do fosfato de Araxá. Melhorias na eficiência de solubilização podem ser obtidas com a combinação desse composto com o ácido cítrico. O fungo A. niger e os ácidos cítrico e oxálico foram capazes de reverter o processo de adsorção de P ao solo in vitro, abrindo perspectivas de aproveitamento do P fixado ao solo na agricultura.Item Identificação e caracterização de uma poliuretanase com atividade lipolítica secretada por Serratia liquefaciens L135 isolada de leite cru(Universidade Federal de Viçosa, 2019-02-26) Salgado, Cleonice Aparecida; Vanetti, Maria Cristina Dantas; 7129515359990634Serratia liquefaciens é uma bactéria frequentemente encontrada no leite cru refrigerado e possui alto potencial de deterioração proteolítica. Neste trabalho, o potencial lipolítico de S. liquefaciens L135, isolada do leite cru refrigerado, foi avaliado e uma enzima lipolítica foi purificada e caracterizada. A atividade lipolítica de S. liquefaciens L135 foi verificada em diferentes temperaturas, sendo 30 °C a temperatura ótima de atividade da enzima. A termoestabilidade da enzima foi avaliada em leite desnatado reconstituído a 10% e o valor D encontrado nas temperaturas de 65, 72, 85 e 95 °C foi de, aproximadamente, 97, 66, 50 e 28 min, respectivamente. O valor Z da enzima foi de 60 °C e a simulação do tempo / temperatura de pasteurização lenta e rápida não resultou na inativação completa da atividade lipolítica. Além disso, esta enzima foi purificada 3,1 vezes com 21,5% de recuperação e apresentou, por zimografia, massa molecular de, aproximadamente, 65 kDa. A identificação por LC-MS/MS indicou tratar-se de uma poliuretanase, com massa molecular teórica de 64,864 kDa, confirmando a estimativa feita por zimografia, e pI teórico de 4,35. A poliuretanase homóloga identificada possui 615 resíduos de aminoácidos, sequência altamente conservada de lipase (GXSXG) que envolve a serina catalítica e é secretada pelo sistema de secreção do tipo I, chamado transportador ABC. In silico, a poliuretanase complexou-se com substratos de cadeia longa, média e curta, confirmando a atividade lipolítica. A poliuretanase exibiu atividade máxima em pH 8,0 e a 30 °C, foi estimulada na presença dos íons Ca 2+ e Ba2+ e inibida pelos íons Zn2+, Cu2+, Fe2+, Co2+, Ni2+ e Mn2+ na concentração final de 10 mM. Na presença de ditiotreitol (DTT), β-mercaptoetanol e dodecil sulfato de sódio (SDS), a atividade da enzima foi aumentada ou pouco influenciada. No entanto, na presença de Tween-80, Triton X-100 e de ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), a atividade lipolítica foi inibida. Além disso, dietil pirocarbonato (DEPC) e fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF), na concentração de 10 mM, inibiram completamente a atividade da poliuretanase, mostrando que os resíduos de serina e histidina são importantes para manter a conformação ativa. Este estudo é o primeiro que descreve que S. liquefaciens isolada do leite cru produz uma enzima lipolítica que apresenta estabilidade nas temperaturas de pasteurização, o que pode comprometer a qualidade do leite e seus derivados.Item Validação do potencial anti-quorum sensing de compostos naturais e anti-inflamatórios em bactérias gram-negativas(Universidade Federal de Viçosa, 2019-03-29) Vargas, Erika Lorena Giraldo; Vanetti, Maria Cristina Dantas; http://lattes.cnpq.br/4757123615552425Quorum sensing (QS) é um mecanismo de comunicação célula-célula mediado por moléculas sinalizadoras que levam à expressão gênica diferencial em resposta a alta densidade populacional. Numerosas espécies de bactérias utilizam este mecanismo de comunicação intra e intercelular para promoverem as mudanças necessárias para adaptação em ambientes diversos. Chromobacterium violaceum é um patógeno humano oportunista que utiliza o QS mediado por acil homoserina lactonas (AHLs) para regular fenótipos como a formação de biofilme, produção de cianeto, síntese do pigmento violeta denominado violaceína, entre outros. Esta bactéria regula a produção de violaceína pelo sistema QS CviI/CviR, que produz e responde a AHLs de diferentes comprimentos de cadeia acila. Ao contrário do sistema de QS por AHLs completo presente em C. violaceum, em Salmonella, esse sistema é incompleto, devido a ausência da sintase da molécula sinal. Entretanto, Salmonella possui a proteína SdiA, homóloga a proteína LuxR, que permite detectar as AHLs produzidas por outras bactérias. Neste trabalho, foi realizada a prospecção in silico de moléculas indutoras do mecanismo de quorum sensing assim como, de prováveis inibidores (quorum quenching-QQ) de C. violaceum e testes in vitro foram realizados para avaliar o efeito destes compostos sobre a produção de violaceína. Além disso, foi testado o efeito do composto fitol e furanona na interferência de processos regulados por QS no metabolismo de Salmonella. Testes in silico mostraram que as AHLs, compostos de plantas e anti-inflamatórios não esteroides (AINEs) foram capazes de se ligar a proteína CviR de C. violaceum com altos escores de afinidade. Além disso, testes in vitro mostraram que a maioria dos compostos testados inibiu a produção de violaceína, sendo que, dentre os compostos de plantas, concentração de 600 µg/mL de ácido margárico e ácido palmítico foi mais efetiva para inibir a produção de violaceína por C. violaceum ATCC 12472 e mutante CV026. No entanto, dentre os AINEs testados na concentração de 500 µg/mL, somente o cetoprofeno mostrou inibição deste fenótipo nas duas estirpes. O crescimento de Salmonella na presença de 0,05 µM de N-dodecanoyl-homoserina lactona (C12-HSL), 0,05 µM de furanona ou 600 µg/mL de fitol durante 24 h de incubação em condições de anaerobiose não foi inibido. Entretanto, na presença de C12-HSL a concentração de tiol livre aumentou em fase exponencial de crescimento com 6 e 7 h de incubação, mas retornou ao mesmo nível observado em células cultivadas na ausência de C12-HSL, quando furanona e fitol foram adicionados na cultura, comparado com o tratamento controle. Os níveis de coenzima NADPH foram significativamente aumentados na presença de C12-HSL, furanona e fitol, enquanto o consumo de glicose foi menor em 6 h de incubação com C12-HSL. A produção de ácidos orgânicos em condições anaeróbias não foi afetada pelas moléculas de QS e QQ. Os resultados do presente trabalho mostraram a importância do docking molecular como uma ferramenta in silico válida para prospecção de compostos QQ em bactérias. A maioria dos compostos indicados in silico como potenciais QQ e testados in vitro inibiu a produção de violaceína em C. violaceum, indicando que podem interferir com o mecanismo de comunicação celular. Além disso, os resultados da influência de moléculas de QS e QQ sobre alguns processos metabólicos em Salmonella revelam a importância de conhecer e compreender os efeitos destes compostos, a fim de encontrar maneiras de reduzir a patogenicidade e, portanto, diminuir o número de surtos de salmonelose registrados em todo o mundo.Item Microbiota do solo de bananeira comercial e do composto orgânico, isolamento de actinobactérias e avaliação do potencial biotecnológico(Universidade Federal de Viçosa, 2019-02-27) Melo, Rita de Cássia Cerqueira; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://lattes.cnpq.br/0842448011353216A bananicultura é uma prática de grande importância socioeconômica difundida mundialmente, e a rizosfera de bananeiras pode apresentar microrganismos benéficos à cultura, bem como fitopatógenos. Da mesma forma, sistemas de compostagens podem veicular microrganismos benéficos e ou indesejáveis para o solo de plantios agrícolas, no processo de adubação. Neste contexto, o primeiro capítulo tem o objetivo de analisar a estrutura e diversidade de bactérias e fungos de solo sob cultivo de bananeira de plantio comercial em dois Estados Brasileiros, Bahia e Ceará, e das fases de um sistema de compostagem; no segundo capítulo, considerando o filo Actinobacteria um dos mais abundantes nestes ambientes, região rizosférica e sistema de compostagem, e com expressivo potencial biotecnológico já descrito, o objetivo foi isolar e identificar actinobactérias e avaliar o seu potencial biotecnológico no controle in vitro de fungos e bactérias patogênicas; e, no terceiro capítulo, a partir dos resultados do capítulo dois, o objetivo foi avaliar in vivo o efeito de bactérias do gênero Streptomyces na promoção do crescimento vegetal de bananeira e na supressão da doença mal-do-Panamá, doença causada pelo fungo Fusarium oxysporum f. sp. cubense, uma das mais importantes doenças da bananeira. Com o resultado das análises de bioinformática, na abordagem independente de cultivo deste trabalho referente ao capítulo um, foi possível observar diferenças na composição taxonômica e abundância de grupos microbianos nas amostras dos dois Estados e nas quatro fases da compostagem. Na abordagem dependente de cultivo, capítulo dois, 62 actinobactérias foram isoladas e identificadas por características morfológicas/culturais e pelo sequenciamento parcial do gene DNAr 16S. A fim de verificar o potencial antagonista in vitro, os 62 de actinobactérias foram avaliados pelo teste de pareamento de culturas contra três fungos filamentosos: Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc), Fusarium oxysporum (FO) e Colletotrichum lindemuthianum (CL). Doze isolados inibiram Foc, 11 inibiram o FO e 44 inibiram o CL, sendo que 10 isolados apresentaram atividade antagonista contra os três fungos filamentosos. Os metabólitos produzidos pelos 12 isolados que inibiram Foc, incluindo os 10 isolados que inibiram os três fungos filamentos, foram liofilizados e avaliados pelo teste de difusão em disco de papel. O extrato de um isolado apresentou atividade contra Candida albicans, cinco apresentaram atividade contra Staphylococcus aureus e sete contra Actinobacillus pleuropneumoniae. Em testes com mudas de bananeira da variedade Prata anã, capítulo três, os 12 isolados promissores para o controle de Foc foram testados in vivo em condições de casa de vegetação, para avaliação do potencial na promoção do crescimento vegetal de bananeira, bem como na supressão da doença mal-do-Panamá. As plantas tratadas com o isolado CAB-C 50 mostraram um maior desenvolvimento, diferindo dos demais tratamentos em função das diferentes variáveis avaliadas: altura da planta, diâmetro do pseudocaule, número de folhas, massa fresca, massa seca (p < 0,01 e 0,001). Na supressão da doença, os tratamentos com os isolados CAB-C 12, CAB-C 21, CAB-C 24, CAB-C 25 e CAB-C 50 foram os que mais diferiram do controle Foc, sendo os tratamentos com os isolados CAB-C 12 e CAB-C 50 os mais promissores. Um consórcio composto por quatro diferentes isolados Streptomyces sp., os mais promissores para o controle do Foc em teste in vitro, mostrou-se eficiente para a redução da doença no período avaliado. Assim, com este trabalho, foi possível verificar diferenças na composição microbiana (bactérias e fungos) em solos sob cultivo de bananeira e em composto maduro (fase IV da compostagem) e que existem actinobactérias com potencial para o controle de microrganismos patogênicos (fungos filamentosos e leveduriformes; e bactérias Gram negativas e Gram positiva) bem como potenciais agentes de promoção do crescimento vegetal de mudas de bananeira da variedade Prata anã. Palavras-chave: Agricultura. Actinomicetos. Controle Biológico. Antibiose. Promoção de crescimento.