Microbiologia Agrícola
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Item Resistência à oxacilina e à vancomicina em Staphylococcus aureus e estafilococos coagulase negativos de diferentes origens(Universidade Federal de Viçosa, 2007-12-21) Oliveira, Rodrigo Coelho de; Moraes, Célia Alencar de; http://lattes.cnpq.br/2338229432406509Os determinantes de resistência aos antimicrobianos vancomicina e oxacilina foram investigados em 264 bactérias do gênero Staphylococcus originados de salame fermentado, de bovinos acometidos com mastite e de casos clínicos humanos. Todos os isolados foram sensíveis ao antibiótico vancomicina e não apresentaram o gene vanA. Dos 57 isolados de salame fermentado, houve um predomínio de CNS, estafilococos coagulase negativos , (89,5%) sobre Staphylococcus aureus (10,5%) e apenas um isolado apresentou-se resistente à oxacilina pelo método de difusão em disco e seu mecanismo de resistência foi proveniente da atividade da -lactamase de expectro extendido). Noventa e cinco isolados de mastite bovina foram submetidos ao teste de atividade da enzima coagulase, predominando a espécie de S. aureus (68,5%), sobre os CNS (32,5%) e ao teste de sensibilidade in vitro, obtendo-se 14 resistentes a oxacilina, sendo dois isolados apresentando o gene mecA e outros 11 atividade de ESBL, predominando este mecanismo de resistência. Dos espécimes clínicos, 52,7% foram CNS e 47,3% S. aureus constituindo 112 isolados, sendo 103 resistentes à oxacilina. Destes, 67 possuíam o gene mecA, 71 apresentaram atividade de ESBL e 40 isolados ambos os mecanismos de resistência. Entre os da espécie S. aureus, predominou a presença do gene mecA como o provável fator de resistência, enquanto nos isolados de CNS, a atividade de ESBL foi mais significativa como possível determinante de resistência. Cinco isolados de origem humana e um de leite mastítico não tiveram seu mecanismo de resistência elucidado, sugerindo ser linhagens MODSA (modified penicillin-binding protein S. aureus) ou outro mecanismo de resistência. Os resultados demonstraram a maior prevalência de resistência a antimicrobianos entre os isolados relacionados a espécimes clínicos humanos seguidos daqueles de vacas mastíticas, bem como a diversidade em possíveis mecanismos de resistência.Item Diversidade de leveduras endofíticas e epifíticas em frutos de café cereja (Coffea arabica L.) e sucessão durante a seca natural(Universidade Federal de Viçosa, 2009-05-08) Vale, Helson Mário Martins do; Borges, Arnaldo Chaer; http://lattes.cnpq.br/1801689011454385A diversidade de leveduras endofíticas e epifíticas em frutos de café cereja das cultivares Catuaí Vermelho, Catuaí Amarelo, Bourbon Vermelho e Bourbon Amarelo em lavouras situadas a diferentes altitudes na Zona da Mata Norte em Minas Gerais, Brasil, foi estudada por metodologias dependentes e independentes de cultivo. A densidade de leveduras epifíticas e endofíticas em frutos de café é variável, menos de 25 UFC.fruto -1 a 6,5 x 10 4 UFC.fruto -1 . As 36 leveduras isoladas foram agrupadas em doze morfotipos e a árvore filogenética reconstruída com dados de sequências de bases de rDNA 26S mostrou o agrupamento com as sequências de Candida smithsonii, Pichia guilliermondii, Cryptococcus flavescens, Meira geulakonigii, Pseudozyma sp e Sporobolomyces sp., já depositadas no National Center for Biotechnology Information (NCBI). O isolado LEM 647-9, proveniente de Bourbon Vermelho, 1101 m, foi o único com identidade correspondente a Meira geulakonigii, um fungo yeast-like classificado em Ustilaginales, a mesma ordem de Pseudozyma. A ocorrência de um só morfotipo de leveduras endofíticas cultiváveis em Malt yeast glucose peptone medium (MYGP), contendo cloranfenicol, em apenas 4 amostras de café cereja é considerada baixa. As endofíticas foram identificadas com base no perfil de ésteres metílicos de ácidos graxos (FAME), pelo sistema de identificação Sherlock ® (MIDI), e por análise filogenética de sequências de rDNA 26S. As sequencias parciais de rDNA destes isolados mostraram identidade entre 96 e 100 % com as correspondentes a Candida, Pichia e Brettanomyces. Pela análise filogenética a maior identidade foi com Candida e Pichia. A constatação de C. diddensiae P. guilliermondii e C. parapsilosis como endofíticas em frutos de café sadios no estádio cereja se configura como relato novo sobre nicho de ocorrência das espécies. Clones de uma biblioteca de rDNA 26S obtida por amplificação de DNA metagenômico de frutos cereja da C.Vermelho, coletada a 1189 m, foram sequenciados. Doze clones mostraram 98-99% de identidade com rDNAs de fungos filamentosos. Estes correspondem a Mycosphaerella, Glomerella, Microdiplodia e Phaeophaeria e a alguns fungos filamentosos potencialmente endofíticos e ainda não identificados, cujas sequências estão presentes no GenBank. A DGGE da sucessão de leveduras associadas aos grãos de C. arabica durante os 14 dias do período de secagem natural no terreiro de cimento revelou UTOs dominantes já nos 4 primeiros dias. A análise com o programa GelCompar II ® demonstrou que o perfil de UTOs da comunidade é alterado a cada dois dias, até o 12o dia de secagem. A determinação de ocorrência e diversidade de leveduras endofíticas nos frutos de café cereja se constitui em etapa fundamental para identificar a síntese de metabólitos produzidos por esses microrganismos e para desenvolver processo biotecnológico que assegure a qualidade superior da bebida do café.Item Desenvolvimento de inoculantes microbianos para biorremediação de solos contaminados com óleo diesel ou gasolina(Universidade Federal de Viçosa, 2009-06-02) Leal, Aline Jaime; Tótola, Marcos Rogério; http://lattes.cnpq.br/2800528729027482No Brasil, os derivados do petróleo, como óleo diesel e gasolina, possuem grande importância econômica, sendo produzidos e distribuídos em larga escala. Vazamentos acidentais desses combustíveis de tanques de armazenamento subterrâneos são causa comum de contaminação do solo e de águas subterrâneas no país. Nesse tipo de acidente, a remediação do solo é muito importante, uma vez que previne a contaminação do lençol freático. Neste trabalho, foram desenvolvidos inoculantes microbianos para a biorremediação de solo contaminado com óleo diesel ou gasolina comercial. Para isso, composto de resíduos sólidos urbanos foi enriquecido em populações microbianas com potencial de degradação de hidrocarbonetos, por meio de adições freqüentes de óleo diesel ou gasolina. Durante esse processo, verificou-se que as populações de bactérias cultiváveis se adaptaram mais rapidamente ao óleo diesel, havendo inicialmente efeito tóxico da gasolina sobre as mesmas. A adição de gasolina ao composto promoveu alterações no perfil de ácidos graxos da comunidade microbiana, sendo observado aumento dos ácidos graxos marcadores de bactérias gram-positivas e diminuição dos marcadores de gram-negativas e de actinomicetos. A aplicação dos inoculantes microbianos ao solo contaminado com gasolina aumentou a degradação desse contaminante, fato atribuído ao estabelecimento de populações microbianas mais resistentes aos efeitos tóxicos dos hidrocarbonetos leves contidos nesse combustível. No solo contaminado com óleo diesel, o efeito da aplicação dos inoculantes foi menos expressivo, em virtude da elevada eficiência de degradação dos microrganismos autóctones do solo. A temperatura de refrigeração foi a mais adequada para o armazenamento dos inoculantes. Nessa condição, houve maior viabilidade das populações bacterianas cultiváveis dos inoculantes e maior eficiência de degradação de hidrocarbonetos no solo. O método desenvolvido neste estudo mostrou-se simples e eficiente para a produção de inoculantes aplicáveis à biorremediação de solos contaminados com hidrocarbonetos.Item Obtenção de mutantes de bactérias psicrotróficas isoladas de leite deficientes na produção de molécula sinal de quorum sensing(Universidade Federal de Viçosa, 2008-07-30) Campos, Maria Emilene Martino; Vanetti, Maria Cristina Dantas; http://lattes.cnpq.br/0138653182683527Quando em alta densidade populacional, muitas bactérias são capazes de coordenar a expressão de genes via produção e recepção de sinais químicos, por meio de mecanismo denominado quorum sensing. O objetivo deste trabalho foi obter mutantes HalI - das estirpes psicrotróficas isoladas do leite cru refrigerado, 068 e 071 de Hafnia alvei e 067 de Enterobacter cloacae. O gene halI codifica a sintase responsável pela produção de acil homoserina lactonas (AHLs) que são as moléculas sinalizadoras de quorum sensing em H. alvei e E. cloacae. Para obtenção dos mutantes, foi utilizado o vetor suicida pGP704, onde foi clonado o gene halI. Em seguida este gene foi interrompido com o gene que codifica a proteína gentamicina- 3-acetiltransferase, que confere resistência ao antibiótico gentamicina e o plasmídeo foi denominado pGP704halI068::Gm. A transformação das estirpes psicrotróficas com esse vetor resultou em transformantes resistentes a 25 μg mL -1 de gentamicina, mas que ainda produziam AHL, constatada por meio da indução da estirpe monitora de AHL, Chromobacterium violaceum CV 026. A inativação da expressão do gene halI no DNA cromossômico foi obtida após nova transformação desses transformantes com o vetor pUT::Tn5, pertencente ao mesmo grupo de compatibilidade de pGP704. O uso deste sistema de incompatibilidade propiciou a seleção de estirpes onde ocorreu a recombinação homóloga entre o gene halI interrompido pelo gene que confere resistência a gentamicina com o gene halI presente no DNA cromossômico. A confirmação da recombinação do gene halI inativado e clonado no plasmideo com o gene halI cromossômico, foi feita selecionando-se os transformantes em ágar Luria Bertani contendo 50 μg mL -1 de canamicina e gentamicina. Por ensaio de indução de C. violaceum CV026, foi confirmado que os transformantes resistentes a canamicina e gentamicina não induziram a produção do pigmento violaceína pela estirpe monitora. A inativação do gene halI no cromossoma torna essas estirpes ferramentas importantes para elucidação da regulação da expressão de genes pelo mecanismo de quorum sensing.Item Bacteriocinas de bactérias do ácido láctico isoladas de salame tipo italiano(Universidade Federal de Viçosa, 2005-10-27) Paula, Rosinéa Aparecida de; Moraes, Célia Alencar deBactérias do ácido láctico, isoladas de salame tipo italiano, com atividade antagonista a Listeria monocytogenes e Staphylococcus aureus foram caracterizadas. A natureza protéica dos agentes antagonistas nas seis linhagens foi demonstrada por serem conservadas em sobrenadantes neutralizados, pela não sensibilidade à catalase e pela sensibilidade a proteases. Cinco perfis de resistência a Proteinase K, Papaína, Tripsina e Protease de Bacillus polimyxa foram observados entre os seis isolados lácticos. Em todos os isolados, a atividade antagonista manteve-se presente em sobrenadantes neutralizados após tratamento térmico de 98 o C por 40 minutos. Em todos os isolados, a atividade inibitória manteve-se independentemente do pH do meio, entre pH 2 e pH 10. O isolado que apresentou melhor inibição contra L. monocytogenes e S. aureus, inclusive em meio líquido, foi identificado pela análise da seqüência de um gene codificador do rRNA 16S e pelo perfil de fermentação de açúcares como Lactococcus lactis subsp. lactis, e aqui denominado L. lactis subsp. lactis PD 6.9. O modo de ação da bacteriocina produzida por L. lactis subsp. lactis PD 6.9 sobre L. monocytogenes foi definido como bactericida. A produção de bacteriocina e o efeito inibitório sobre L. monocytogenes em condições que simulam o salame foram demonstrados. L. lactis subsp. lactis PD 6.9 atingiu 10 9 UFC/mL e a bacteriocina foi detectada após 8 horas. Em estudo de co-cultivo com L. monocytogenes, o crescimento de L. lactis subsp. lactis PD 6.9 não foi afetado pela presença de L. monocytogenes e apresentou o mesmo comportamento que quando cultivado como monocultura. Porém, o crescimento de L. monocytogenes foi reprimido e o número inicial de 10 6 células foi mantido até aproximadamente 12 horas de cultivo e nenhum crescimento foi detectado após 32 horas em um limite de detecção de 10 UFC/mL. A atividade da bacteriocina produzida por L. lactis subsp. lactis PD 6.9, em meio D-MRS, surge no final da fase logarítmica de crescimento e é máxima na fase estacionária. A atividade foi mais alta em condições ácidas do que em básicas, com atividade máxima em pH 2 e não foi alterada por tratamento térmico a 121 o C por 20 minutos, pelo processo de liofilização ou pelo efeito de congelamento e descongelamento. O armazenamento da bacteriocina nas temperaturas de -20 o C e -80 o C por até 6 meses também não alterou a atividade de inibição. A purificação foi realizada utilizando precipitação com sulfato de amônio, cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica e HPLC- fase reversa. Grande perda de atividade da bacteriocina foi observada especialmente após cromatografia de troca iônica e somente 0,025% da atividade inicial foi recuperada após HPLC-fase reversa. Os resultados obtidos com a purificação indicam que a bacteriocina é pequena, catiônica, hidrofóbica e com capacidade de formar agregados.Item Desenvolvimento de processos para a produção de probióticos com Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20(Universidade Federal de Viçosa, 2005-02-21) Leite, Mauricio de Oliveira; Teixeira, Magdala Alencar; http://lattes.cnpq.br/3386841827689188O objetivo deste trabalho foi definir as rotas tecnológicas para o desenvolvimento de processos de produção de probióticos contendo células de Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20, bem como o de analisar a viabilidade técnica dos processos identificados, considerando a otimização do conjunto das etapas de cada processo. A produção de concentrado de células de L. delbrueckii UFV H2b20, a ser usado em todos os produtos, foi estabelecida em soro de queijo Minas Frescal esterilizado por calor. As condições ótimas para a esterilização foram determinadas. O rendimento em células foi da ordem de 10 9 UFC/mL. Os probióticos produzidos foram leite fermentado com L. delbrueckii UFV H2b20, leite em pó e sorvete contendo células viáveis dessa bactéria; foram produzidos também leite UHT, leite pasteurizado e leite em pó contendo células inativadas pelo calor. O leite fermentado apresentou valores de pH entre 4,0 a 4,5 e aproximadamente 10 8 UFC/g, e, estocado a 5oC, manteve-se nestas condições por até 30 dias; após 45 dias, a contagem foi de 10 7 UFC/g, valor ainda em conformidade com o estabelecido pela Resolução 47/97 de GMC para probióticos. O sorvete apresentou contagem na ordem de 10 8 UFC/g até 45 dias a -20oC. Após 60 dias nessa temperatura, houve redução para 10 7 UFC/g, contagem estável até 90 dias. O leite em pó probiótico foi produzido com células pré-tratadas para melhor sobrevivência ao processo em spray dryer, rendendo 10 8 UFC/g de L. delbrueckii UFV H2b20. Este número reduziu- se 10 7 UFC/g em 90 dias de estocagem a -20oC e a 10 6 e 10 5 à temperatura ambiente após 60 e 90 dias, respectivamente. A adição de células inativadas no leite pasteurizado não causou alterações no pH e na acidez do produto. No leite contendo células inativadas, houve desenvolvimento de proteólise e a conseqüente coagulação das proteínas após 30 dias de estocagem do produto, tornando seu processo inviável. As rotas tecnológicas definidas, o estudo de viabilidade técnica e a análise dos processos levaram a conclusões que recomendam a submissão de pedido de patente em função de três pontos demonstrados como inovações em processos.Item Consórcio bacteriano para biorremediação de solo contaminado com gasolina(Universidade Federal de Viçosa, 2005-02-23) Parreira, Adriano Guimarães; Tótola, Marcos Rogério; http://lattes.cnpq.br/1803178442452988Cinqüenta e dois isolados microbianos pertencentes ao Laboratório de Biodiversidade e Biotecnologia para o Meio Ambiente (LBBMA) do Departamento de Microbiologia, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG, foram avaliados quanto à capacidade de crescimento em gasolina pura, gasolina adicionada de 25% de etanol, benzeno, tolueno e xilenos. A capacidade de produzirem biossurfactante em substrato contendo gasolina comercial como fonte de carbono foi também avaliada. Os 16 isolados que apresentaram crescimento considerado satisfatório em meio suplementado com gasolina pura foram avaliados quanto à capacidade de utilização de benzeno, tolueno ou xileno (BTX) como fontes exclusivas de carbono. Os quatro melhores foram selecionados para comporem um consórcio microbiano a ser estudado em biorreatores construídos para esse fim, sendo identificados pela análise de ésteres metílicos de ácidos graxos (FAME) como sendo: Stenotrophomonas maltophilia (isolado BBMA 105A), Sphingomonas capsulata (isolado LBBMA 178b) e Pseudomonas balearica (isolado LBBMA 193).O isolado BBMA B1 encontra-se em vias de identificação. Além desses, o isolado LBBMA 53A, identificado como Pseudomonas aeruginosa e o isolado LBBMA 178, também pertencente ao gênero Pseudomonas, foram selecionados por serem os mais eficazes quanto à produção de biossurfactantes. A identificação de S. capsulata como degradadora de tolueno e de P. balearica como degradadora de xileno, representa o acréscimo de mais uma característica metabólica relevante na descrição dessas espécies. O estudo da otimização do processo de biorremediação de amostra de solo contaminado com gasolina em biorreatores, considerando as variáveis fornecimento de oxigênio, fornecimento de nutrientes minerais e inoculação do consórcio bacteriano, permitiu a seleção das condições propícias à degradação de BTX pelo consócio microbiano selecionado. O consórcio microbiano demonstrou ser eficiente na biorremediação de solo contaminado com gasolina comercial. A utilização de um composto liberador de oxigênio não foi eficiente em estimular a biodegradação de hidrocarbonetos. A injeção de ar foi comprovadamente a melhor forma de suprimento de oxigênio ao processo de biorremediação conduzido em birreatores. A inoculação do slurry com o consórcio selecionado neste trabalho promoveu um aumento significativo da degradação dos componentes da gasolina, em especial BTX, demonstrando ser uma estratégia promissora para a biorremediação de solos contaminados com gasolina.Item Immuno-dot blot para detecção do vírus da dengue em Aedes aegypti e em Aedes albopictus(Universidade Federal de Viçosa, 2004-04-20) Andrade, Adriana Gomes de; Mezencio, Jose Mario da Silveira; http://lattes.cnpq.br/1263471257819136A avaliação de viabilidade de uso da técnica de immuno-dot blot para a detecção do vírus da dengue em homogenatos de larvas e de mosquitos Aedes aegypti e larvas de Aedes albopictus foi realizada utilizando-se soros humanos reativos para dengue e soros policlonais antidengue, produzidos em coelhos da raça Nova Zelândia imunizados com suspensões de vírus DEN-1 (Havaí) e DEN-2 (Nova Guiné) purificados e emulsificadas em adjuvante incompleto de Freund. Os resultados demonstraram que a técnica apresenta sensibilidade adequada para a detecção do vírus da dengue em homogenatos de larvas e de mosquitos A. aegypti e larvas de A. albopictus ainda que os títulos dos anti- soros sejam baixos. A presença do vírus foi detectada em larvas do mosquito A. albopictus, o que pode contribuir para o monitoramento do vírus mesmo na ausência de surtos da doença. Pode, inclusive, contribuir para estudos epidemiológicos mais amplos desse vírus por fornecer ferramenta para esses estudos.Item Resistência a antimicrobianos e biocidas em bactérias isoladas de pacientes e ambiente hospitalares(Universidade Federal de Viçosa, 2003-08-25) Chequer, Simone Silva Iamin; Moraes, Célia Alencar deBactérias Gram positivas e Gram negativas foram isoladas de pele de pacientes, de espécimes clínicos e do ambiente de um Centro de Terapia Intensiva hospitalar com o objetivo de estudar sua resistência a agentes biocidas e outros antimicrobianos. Dos trinta e oito isolados do ambiente, treze foram identificados como Staphylococcus sp.; sete como S. aureus; dez como Acinetobacter sp.; um como Acinetobacter baumannii; e sete como Pseudomonas aeruginosa. Na pele de pacientes, dos dezessete isolados, encontraram-se sete de P. aeruginosa; cinco de Staphylococcus sp.; quatro de Escherichia coli; e um de S. aureus. Entre os dez isolados dos espécimes clínicos, três foram identificados como P. aeruginosa; três como Staphylococcus sp.; dois como A. baumannii; um como Acinetobacter sp.; e um como Stenotrophomonas altophila. A resistência a cinco ou a mais antimicrobianos foi freqüente na maioria dos isolados de P. aeruginosa e S. aureus. Os isolados de P. aeruginosa, provenientes da pele de pacientes, apresentaram-se mais multirresistentes quando comparados à linhagem-tipo, e houve prevalência de sulfametoxazol/trimetoprim resistência e a à tetraciclina, perfloxacina. Houve cloranfenicol, prevalência de sensibilidade a imipenem, ciprofloxacina, norfloxacina, ceftazidima e a amicacina. Os três isolados de A. baumannii apresentaram sensibilidade a imipenem e resistência a norfloxacina, cloranfenicol, sulfametoxazol/trimetoprim, amicacina, gentamicina, perfloxacina, tetraciclina, cefotaxima, ceftazidima, ceftriaxona e ciprofloxacina. Destes, dois isolados foram sensíveis à fosfomicina. Todos os oito isolados identificados como S. aureus apresentaram sensibilidade a fosfomicina; seis a amicacina; e cinco a tetraciclina, ciprofloxacina e vancomicina. Todos foram resistentes à penicilina; sete a norfloxacina, eritromicina, gentamicina, oxacilina e cefoxitina; seis a clindamicina e ticarcilina/ácido clavulânico; e cinco, a cefalotina. As concentrações inibitórias mínimas (MIC) do digluconato de clorhexidina indicam maior suscetibilidade da espécie S. aureus, quando comparada com P. aeruginosa e A. baumannii. Houve diferença de resistência entre os isolados de diferentes origens, principalmente entre os identificados como P. aeruginosa. Isolados de A. baumannii apresentaram MICs, para polivinilpirrolidona-iodo (PVP-I), pelo menos duas vezes maiores que a linhagem de referência. MICs de PVP-I em P. aeruginosa e S. aureus não foram muito superiores aos encontrados nas respectivas linhagens-tipo. Não houve correlação entre a resistência aos antimicrobianos e aos biocidas.Item Efeito de choques térmico e ácido na resistência de Lactobacillus UFV H2b20 em leite em pó(Universidade Federal de Viçosa, 2001-11-05) Furtado, Waléria Cristina de Arruda; Moraes, Célia Alencar de; http://lattes.cnpq.br/6073903060440473Os efeitos do choque térmico, 50 o C por 30min, e do choque ácido, em pH3,5 por 2h e 30min a 37 o C, na sobrevivência de Lactobacillus UFV H2b20 à desidratação em “spray dryer” a 180 o C e na resistência a condições ambientais foi estudado. Em relação ao controle, em leite contendo 10% EST após o processamento do leite em pó, observou-se que tanto o choque térmico quanto o choque ácido conferiram às células maior tolerância ao processo de desidratação testado, sendo a diferença na sobrevivência de quase 2 ciclos logarítmicos. Fica demonstrado o efeito protetor do choque térmico e do choque ácido ao tratamento a 65 o C, por 20min, em que o controle, cerca de 10 3 UFC/ml, não logrou sobrevivência, enquanto as células pré-tratadas sofreram redução de apenas 2 ciclos logarítmicos. O mesmo efeito protetor ao tratamento em pH2,5 por 2h e 30min foi observado. No tratamento em 0,8mg/ml de lisozima por 60min não foi verificado efeito protetor ou deletério desses pré-tratamentos. No tratamento com 1% de sais biliares, verifica-se maior sobrevivência do controle quando comparado com as amostras pré-tratadas. Houve sobrevivência de 10% xdas células do controle e 1% das células pré-tratadas, nos primeiros 30min de exposição. Nas células submetidas ao choque ácido, houve efeito deletério nos primeiros 30min e efeito protetor nos demais períodos demonstrando seu efeito protetor na manutenção do número de células sobreviventes a esse tratamento. Observou-se melhor efeito do tratamento com ácido, quando comparado ao choque térmico.