Microbiologia Agrícola
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Item Análise genômica e determinação do proteoma referência de isolados clínicos de Actinobacillus pleuropneumoniae sorotipo 8(Universidade Federal de Viçosa, 2016-02-22) Prado, Isabelle Gonçalves de Oliveira; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://lattes.cnpq.br/3640365647553917Actinobacillus pleuropneumoniae é o agente etiológico da pleuropneumonia suína, uma doença respiratória severa que resulta em significantes perdas econômicas no setor da suinocultura. Atualmente, A. pleuropneumoniae é classificado em 16 sorotipos diferentes que podem causar a doença com virulência distinta entre eles. Em Minas Gerais, Brasil, A. pleuropneumoniae é encontrado nas granjas e a maior distribuição é do sorotipo 8, sendo este até pouco tempo negligenciado em estudos de epidemiologia devido a problemas de identificação. Da mesma forma, atualmente é aceito que este sorotipo é também o de maior distribuição nos Estados Unidos, Canadá, Reino Unido além do Brasil. Até recentemente, não havia disponibilidade de genomas de A. pleuropneumoniae sorotipo 8 em banco de dados, por isso não existem informações genômicas específicas para este sorotipo, especialmente provenientes de isolados clínicos recentemente circulantes nas granjas. Neste contexto, somente a partir de 2015 os primeiros genomas foram disponibilizados para serem analisados, sendo assim sete genomas de isolados clínicos de A. pleuropneumoniae sorotipo 8 estão hoje disponíveis e estes foram analisados neste estudo. A partir das sequências genômicas dos isolados clínicos de A. pleuropneumoniae sorotipo 8 foi proposto um modelo de proteoma referência desse sorotipo com um total de 2.396 proteínas categorizadas nas diferentes classes de grupos de ortólogos. Na análise comparativa realizada entre genomas de A. pleuropneumoniae sorotipo 8 e demais sorotipos foi observado um padrão de conservação na organização do genoma entre esses. No entanto, foram identificadas algumas diferenças pontuais e dois segmentos genômicos diferenciais entre os genomas analisados com rearranjos e /ou inversões de 42,2 Kb e 59,6 Kb. O primeiro segmento foi encontrado nos genomas dos sorotipos 5 (L20), 7 (AP76) e em quatro dos isolados clínicos do sorotipo 8 investigados, sendo eles MV518, MV780, MV1022 e MV5651 contendo sequências de profago. O segundo segmento diferencial foi identificado apenas no genoma de A. pleuropneumoniae sorotipo 7 (AP76) e contém sequências como transposases caracterizando a presença de uma sequência de inserção no segmento. De acordo com a análise dos códons preferenciais de todos os sorotipos investigados, não foram observadas diferenças marcantes entre eles. Na análise comparativa dos proteomas, a maioria das sequências do proteoma referência de A. pleuropneumoniae sorotipo 8 que apresentaram baixa similaridade com os demais sorotipos foram caracterizadas como hipotéticas, não tendo sua função conhecida. Nessa porção diferencial específica foram relatadas sequências codificadoras relacionadas à plasmídeos o que caracteriza possíveis eventos de transferência horizontal de genes (THG) ao longo da história evolutiva do genoma e fatores de resistência a antibióticos como cloranfenicol, sulfonamida e tetraciclina. Na análise de similaridade entre os proteomas houve maior similaridade das proteínas do proteoma referência do sorotipo 8 com as proteínas do sorotipo 6, o que pode estar associado à dificuldade em separar esses sorotipos nas técnicas de sorotipagem. Com as análises comparativas e a caracterização das diferenças entre os sorotipos e isolados será possível compreender os mecanismos de virulência dos isolados de A. pleuropneumoniae e identificar potenciais candidatos vacinais mais eficientes.Item Metagenômica de um consórcio microbiano termofílico na detecção de genes de enzimas celuloliticas e expressão heteróloga em Kluyveromyces marxianus CCT 7735 (UFV-3)(Universidade Federal de Viçosa, 2015-03-13) Colombo, Lívia Tavares; Passos, Flávia Maria Lopes; http://lattes.cnpq.br/4745874654946687Neste trabalho foi construída uma biblioteca metagenômica a partir de um consórcio microbiano termofílico com aproximadamente 135.000 clones, abrigando cerca de 3,5 Gpb de DNA metagenômico. Essa biblioteca foi construída com o objetivo de identificar genes que codificam enzimas lignocelulolíticas para serem expressos na levedura Kluyveromyces marxianus CCT 7735 (UFV-3). De 6.720 clones analisados (5 % do total), foram obtidos 182 hits positivos para atividades de celulases, xilanases e β-glicosidases, com seleção e sequenciamento de 30 fosmídeos que deram origem à identificação de 34 ORFs codificando para enzimas glicosil hidrolases, relacionadas com a hidrólise de celulose e hemicelulose. Paralelo à construção da biblioteca, foi obtido uma linhagem de K. marxianus CCT 7735 (UFV- 3) mutante (ura3 ̄ ). Pela primeira vez nesta levedura a deleção deste gene foi realizada utilizando-se a técnica split-marker, com seleção dos mutantes primeiramente em placas contendo geneticina e, posteriormente, associados à seleção em placas contendo ácido 5-fluorótico (5-FOA). Os resultados apresentados mostram que esta técnica de deleção pode ser eficientemente empregada para K. marxianus CCT 7735 (UFV-3), mesmo levando-se em conta a diploidia desta linhagem. A partir da obtenção do mutante ura3 ̄ , deu-se a construção do vetor pKmLPG para ser usado como sistema de expressão para essa levedura, uma vez que a marca de seleção contida neste vetor é o gene URA3. A característica diferencial e promissora deste sistema de expressão é o uso da sequência do promotor do gene que codifica a enzima endo-polygalacturonase endógena de K. marxianus CCT 7735 (UFV-3). A confirmação do vetor pKmLPG será realizada por sequenciamento. Sem essa confirmação, utilizou-se então o vetor de expressão pKMCL para clonagem de três genes de β-glicosidase isolados a partir da biblioteca fosmidial na levedura K. marxianus CCT 7735 (UFV-3). O vetor pKMCL é derivado do vetor de expressão pKLAC2 de K. lactis e utiliza a marca de seleção que confere resistência ao antibiótico geneticina. Por realização de teste enzimático dos transformantes em meio sólido, observou-se a presença de atividade extracelular de β-glicosidase endógena de K. marxianus CCT 7735 (UFV- 3). Com o genoma desta levedura anotado, foi possível identificar o gene, e juntamente com os demais genes de β-glicosidase (P3Gli, P8Gli e P9Gli), foram preditas as estruturas tri-dimensionais dessas proteínas. A confirmação dos transformantes para os genes P3Gli, P8Gli e P9Gli foi realizada por PCR, e atividade de β-glicosidase foi detectada tanto no sobrenadante extracelular quanto na região do periplasma em oito das nove cepas transformantes analisadas. Os resultados de expressão heteróloga de β-glicosidades em K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) mostram que esta linhagem pode ser usada como hospedeira na expressão de diferentes genes lignocelulolíticos, com expectativa de uso das linhagens recombinantes capazes de secretar celulases visando a produção de etanol celulósico.Item Respostas fisiológicas e moleculares de Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20 aos estresses ácido e por sais biliares(Universidade Federal de Viçosa, 2011-03-29) Ferreira, Alessandra Barbosa; Moraes, Célia Alencar de; http://lattes.cnpq.br/7149975150225344O presente trabalho teve por objetivo estudar as respostas fisiológicas e morfológicas de células de Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20 aos estresses ácido e por sais biliares, alem de identificar e realizar análises filogenética e de expressão de genes possivelmente relacionados a esses estresses. Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20 não cresce em caldo MRS pH 3,5 entretanto, células mantidas neste meio por quatro horas toleram o estresse ácido, como demonstrado por curvas de sobrevivência. A maior tolerância da bactéria aos sais biliares mistos e a menor ao ácido glicodeoxicólico são características de L. delbrueckii UFV H2b20 submetida a estes estresses, em estudo in vitro. A análise da morfologia das células por Microscopia de Força Atômica (MFA) mostrou que os estresses ácido e por sais biliares provocaram alterações na morfologia da célula - a superficie da parede se apresentou rugosa com acentuada redução na dimensão correspondente à altura, em todas as condições de estresse testadas. Em conjunto, os resultados demonstram caracteristicas de respostas fisiológicas de L. delbrueckii UFV H2b20 aos estresses ácido e por sais biliares desejáveis e necessárias em bactéria probiótica, ou seja, resistir e sobreviver em condições similares às prevalecentes no trato gastrointestinal (TGI) de humanos. Os genes clpP, clpE, clpL e cle de L. delbrueckii UFV H2b20, cujos produtos pertencem ao complexo proteolítico Clp apresentaram alta identidade de sequência, variando de 96 a 97 % com as de Lactobacillus delbreuckii subsp. bulgaricus ATCC 11842. As árvores filogenéticas reconstruídas por Inferência Bayesiana mostraram os genes clpP, clpL e clpE agrupados com os de L. delbreuckii subsp. bulgaricus ATCC 11842. As exposições das células aos meios MRS pH 3,5, MRS contendo O,l % de sais biliares mistos e a MRS contendo O,l % de ácido glicodeoxicólico por 30 e 60 minutos aumentaram a expressão dos quatro genes, enquanto a exposição a ácido taurodeoxicólico aumentou apenas a do gene clpL. Considerando o envolvimento dos genes clpP, clpL, clpE e cle nas respostas aos estresses ácido e por sais biliares infere-se que a atividade do complexo proteolítico Clp pode representar mecanismo de reparo e/ou degradação de proteínas danificadas pelas condições de estresse analisadas neste estudo. Os genes codificadores de ornitina descarboxilase e de permease de aminoácido identificados em L. delbrueckii UFV H2b20 agruparam na reconstrução filogenética com os de L. delbreuckii subsp. bulgaricus ATCC 11842, sendo de 96 a 98 % a identidade das sequências. O aumento da expressão do gene que codifica a ornitina descarboxilase após a exposição das células por 30 e 60 minutos em MRS pH 3,5, meio rico, mostra o envolvimento deste gene na resposta ao estresse ácidoem L. delbrueckii UFV H2b20 e evidencia que a proteína codificada por esse gene é a envolvida na regulação do pH intracelular. Sugere- se a descarboxilação de aminoácidos como mecanismo de adaptação à condição de acidez do meio. Com o estudo da expressão dos genes spx, dps e pax, todos envolvidos no estresse oxidativo em L. delbrueckii H2b20, caracterizou-se base molecular envolvida no fenômeno de proteção cruzada in vitro ao constatar-se a sobreposição e a inespecificidade de genes aos estresses investigados. Particularmente, o aumento da expressão do gene dps após exposição das células aos meios MRS pH 3,5 e MRS contendo 0,1 % de ácido glicodeoxicólico foi interpretado como mecanismo de proteção do DNA a acidez interna das células. No presente estudo, bases fisiológicas e moleculares que possibilitam a probiose por L. delbrueckii UFV H2b20 ficam esclarecidas no que tange à existência de mecanismos para sobrevivência e persistência em condições presentes no TGI de humanos.