Microbiologia Agrícola
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Item Assessment of ethanol tolerance of Kluyveromyces marxianus CCT 7735 selected by adaptive laboratory evolution(Universidade Federal de Viçosa, 2018-08-29) Silveira, Fernando Augusto da; Silveira, Wendel Batista da; http://lattes.cnpq.br/4876491797184708Whey is a by-product formed during the cheese-making, which presents lactose (4.5-5% w/v), soluble proteins, lipids, mineral salts and other components. It is the most abundant liquid waste generated in the dairy industries, which can lead to the pollution of water bodies due to its high biochemical oxygen demand and chemical oxygen demand. Whey permeate (WP) is a by-product constituted by lactose, produced from whey ultrafiltration. This way, WP can be converted by lactose-assimilating microorganisms, like yeasts, into value-added products. Kluyveromyces marxianus CCT 7735 has been showing a great potential for producing ethanol from lactose. However, its low ethanol tolerance is a drawback to be overcome, i. e., its growth is highly inhibited from 4% of ethanol (v/v). Adaptive laboratory evolution was used to select ethanol-tolerant K. marxianus CCT 7735 strains (ETSs). ETSs were grown under ethanol stress (4%, v/v) for long periods of time, over many generations (310-340 number of generations), in order to select the ethanol-tolerant phenotypes. From the determination of the physiological parameters, ETSs did not present alterations in their fermentative capacity, when compared their parental strains. However, ETS4 strain stood out for displaying a specific growth rate higher than the parental strain under ethanol stress (above 100%) and a specific ethanol production rate superior to all strains evaluated in this work. The metabolomic and fatty acids analysis were carried out with both ETS4 and parental strains to gain insights into the mechanisms related to the acquisition of ethanol tolerance. The accumulation of some amino acids (glutamate, alanine, valine, proline, and leucine) and metabolites of the citric acid cycle (isocitric acid, citric acid, cis-aconitic acid and malic acid) in ETS4 was found to be associated with the acquisition of ethanol tolerance. Furthermore, high fatty acids content and ergosterol in ETS4 compared to the parental strain indicate differences in their plasma membrane composition, which is consistent with metabolite leakage observed in the parental strain. Therefore, the accumulation of amino acids and citric acid cycle metabolites, as well as the alteration in the fatty acid and ergosterol contents contributed to the acquisition of ethanol tolerance in K. marxianus.Item Identificação de proteínas secretadas por Kluyveromyces marxianus e atividade antagonista contra Botrytis cinerea(Universidade Federal de Viçosa, 2017-07-25) Santos, Ana Maria dos; Fietto, Luciano Gomes; http://lattes.cnpq.br/9859628931741246A conservação de frutos in natura com qualidade é primordial para reduzir as perdas no período após a colheita, devido à recorrente contaminação por fungos patogênicos. No entanto, a forma usual de controle por fungicidas e agentes químicos vem causando danos ao meio ambiente, à saúde humana e selecionando linhagens de patógenos resistentes. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito antagonista da levedura Kluyveromyces marxianus e seu mecanismo de ação contra o fitopatógeno Botrytis cinerea. Os resultados obtidos mostram que K. marxianus é capaz de secretar simultaneamente enzimas hidrolases envolvidas na degradação da ultra-estrutura da parede celular fúngica. O extrato protéico secretado foi testado contra os substratos Azocaseína e ρ-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo e apresentou atividades de glicosidase e proteásica para todas as linhagens testadas. O sequenciamento, por espectrometria de massas, das proteínas majoritárias que foram visualizadas em SDS-PAGE identificou vinte e sete proteínas, sendo 13 delas classificadas como hidrolases. Entre as hidrolases foram identificadas 4 β-glicanases, 4 glicosidases, uma protease aspártica, uma endoquitinase e uma inulinase. Quando se avaliou o efeito do extrato enzimático secretado por K. marxianus sobre a ultra-estrutura da parede celular de Saccharomyces cerevisiae foi observado um dano substancial, causando deformações celulares e redução da viabilidade da população de células. Neste trabalho foi observada a atividade de antagonismo da K. marxianus in vitro e in vivo utilizando conhecidos alvos do patógeno Botrytis cinerea: morangos e uvas de mesa. Os resultados obtidos dos testes de antagonismo in vitro mostram que em cultivo simultâneo K. marxianus inibe 88% a germinação de esporos de B. cinerea (p-valor 0,0003) nas primeiras 12h, sugerindo que, além da competição por nutrientes, a inibição do crescimento micelial esteja relacionada com a capacidade de secretar enzimas líticas exibidas pela levedura antagonista. Os resultados dos testes in vivo em uvas não mostraram atividade de antagonismo da K. marxianus contra B. cinerea. Os resultados dos testes in vivo em morangos sugerem que a habilidade de secretar enzimas líticas fazem da K. marxianus um agente potencial para o controle biológico de B. cinerea.Item Produção de etanol em permeado de soro de queijo por Kluyveromyces marxianus UFV-3(Universidade Federal de Viçosa, 2004-02-16) Silveira, Wendel Batista da; Passos, Flávia Maria Lopes; http://lattes.cnpq.br/7361036485940798Com o objetivo de estabelecer a condição fisiológica para a conversão máxima da lactose do permeado de soro de queijo em etanol, avaliaram-se os efeitos da concentração de substrato e do nível de oxigênio no direcionamento do fluxo metabólico para a via fermentativa da levedura K. marxianus UFV-3. Inicialmente, as fermentações foram conduzidas em meio YNB sintético com altas concentrações de lactose, em condições aeróbica e microaeróbica (injeção de nitrogênio gasoso por 12 minutos), em regime de batelada. Nas fermentações sob microaerobiose, os rendimentos máximos de etanol por substrato foram próximos a 85% do rendimento teórico, ou seja, superiores aos obtidos em aerobiose, por volta de 55% desse rendimento. O rendimento de etanol máximo por massa celular também foi maior em microaerobiose, sendo a produtividade volumétrica maior em microaerobiose apenas na fermentação, cuja concentração inicial de lactose foi de 67,0 g L -1 . As fermentações realizadas em permeado de soro de queijo com 10 diferentes concentrações de lactose, que variaram de 1,0 g L -1 a 240,0 g L -1 , em regime de batelada, sob condições aeróbica, microaeróbica e anaeróbica (injeção de nitrogênio gasoso por todo o tempo de fermentação), apresentaram rendimento máximo de etanol por substrato e por massa celular, bem como de produtividade máxima volumétrica, superior àqueles obtidos em YNB. Além disso, K. marxianus UFV- 3 exibiu maiores velocidades específicas de crescimento, maior produção de massa celular e maior produção de glicerol nas fermentações em permeado que naquelas em YNB. Os parâmetros fermentativos da produção de etanol em permeado foram maiores em microaerobiose e anaerobiose do que em aerobiose. As fermentações em permeado – cujas concentrações iniciais de lactose foram acima de 50 g L -1 – e o nível de oxigênio reduzido (microaerobiose e anaerobiose) apresentaram altos rendimentos máximos de etanol por substrato, correspondendo a quase 100% do teórico. A velocidade de consumo de lactose e de produção de etanol aumentou à medida que a concentração inicial de substrato também aumentou e o nível de oxigênio diminuiu. A tolerância do produto (etanol) foi verificada no permeado acrescido de etanol, em concentrações que variaram de 5 a 80 g L -1 . Em 50 gL -1 , K. marxianus UFV-3 manteve um crescimento próximo a 80% em relação ao controle em condição anaeróbica e perto de 60% sob condições microaeróbica e aeróbioca.Item Metagenômica de um consórcio microbiano termofílico na detecção de genes de enzimas celuloliticas e expressão heteróloga em Kluyveromyces marxianus CCT 7735 (UFV-3)(Universidade Federal de Viçosa, 2015-03-13) Colombo, Lívia Tavares; Passos, Flávia Maria Lopes; http://lattes.cnpq.br/4745874654946687Neste trabalho foi construída uma biblioteca metagenômica a partir de um consórcio microbiano termofílico com aproximadamente 135.000 clones, abrigando cerca de 3,5 Gpb de DNA metagenômico. Essa biblioteca foi construída com o objetivo de identificar genes que codificam enzimas lignocelulolíticas para serem expressos na levedura Kluyveromyces marxianus CCT 7735 (UFV-3). De 6.720 clones analisados (5 % do total), foram obtidos 182 hits positivos para atividades de celulases, xilanases e β-glicosidases, com seleção e sequenciamento de 30 fosmídeos que deram origem à identificação de 34 ORFs codificando para enzimas glicosil hidrolases, relacionadas com a hidrólise de celulose e hemicelulose. Paralelo à construção da biblioteca, foi obtido uma linhagem de K. marxianus CCT 7735 (UFV- 3) mutante (ura3 ̄ ). Pela primeira vez nesta levedura a deleção deste gene foi realizada utilizando-se a técnica split-marker, com seleção dos mutantes primeiramente em placas contendo geneticina e, posteriormente, associados à seleção em placas contendo ácido 5-fluorótico (5-FOA). Os resultados apresentados mostram que esta técnica de deleção pode ser eficientemente empregada para K. marxianus CCT 7735 (UFV-3), mesmo levando-se em conta a diploidia desta linhagem. A partir da obtenção do mutante ura3 ̄ , deu-se a construção do vetor pKmLPG para ser usado como sistema de expressão para essa levedura, uma vez que a marca de seleção contida neste vetor é o gene URA3. A característica diferencial e promissora deste sistema de expressão é o uso da sequência do promotor do gene que codifica a enzima endo-polygalacturonase endógena de K. marxianus CCT 7735 (UFV-3). A confirmação do vetor pKmLPG será realizada por sequenciamento. Sem essa confirmação, utilizou-se então o vetor de expressão pKMCL para clonagem de três genes de β-glicosidase isolados a partir da biblioteca fosmidial na levedura K. marxianus CCT 7735 (UFV-3). O vetor pKMCL é derivado do vetor de expressão pKLAC2 de K. lactis e utiliza a marca de seleção que confere resistência ao antibiótico geneticina. Por realização de teste enzimático dos transformantes em meio sólido, observou-se a presença de atividade extracelular de β-glicosidase endógena de K. marxianus CCT 7735 (UFV- 3). Com o genoma desta levedura anotado, foi possível identificar o gene, e juntamente com os demais genes de β-glicosidase (P3Gli, P8Gli e P9Gli), foram preditas as estruturas tri-dimensionais dessas proteínas. A confirmação dos transformantes para os genes P3Gli, P8Gli e P9Gli foi realizada por PCR, e atividade de β-glicosidase foi detectada tanto no sobrenadante extracelular quanto na região do periplasma em oito das nove cepas transformantes analisadas. Os resultados de expressão heteróloga de β-glicosidades em K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) mostram que esta linhagem pode ser usada como hospedeira na expressão de diferentes genes lignocelulolíticos, com expectativa de uso das linhagens recombinantes capazes de secretar celulases visando a produção de etanol celulósico.Item Produção de etanol em biomassa de capim-elefante por Kluyveromyces marxianus CCT 7735(Universidade Federal de Viçosa, 2015-07-27) Campos, Breno Barcellos; Silveira, Wendel Batista da; http://lattes.cnpq.br/8786438627267312O capim-elefante é uma gramínea de elevada produtividade, que apresenta grande potencial para ser utilizado como biomassa lignocelulósica para a produção de etanol de segunda geração. A levedura Kluyveromyces marxianus vem se destacando na produção de etanol celulósico em processos de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) por ser termotolerante, além de produzir outros metabólitos de interesse industrial. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi estabelecer as condições ótimas de produção de etanol por Kluyveromyces marxianus CCT 7735 por meio do processo SSF. O capim- elefante foi pré-tratado com ácido diluído e com solução alcalina e, em seguida, o resíduo celulósico obtido foi submetido a uma pré-sacarificação durante 72 horas, seguido por 120 horas de SSF. Foram avaliados o efeito de cinco variáveis: temperatura, pH, agitação, concentrações de enzimas e de resíduo celulósico de capim-elefante (biomassa) durante 120 horas de SSF. Os resultados mostraram que a levedura termotolerante K. marxianus CCT 7735 produziu etanol nos tratamentos realizados a 45 °C, temperatura próxima à ótima para a atividade das enzimas celulolíticas. A concentração de biomassa, temperatura e concentração do complexo enzimático tiveram efeito significativo (p valor < 0,05) no processo. A maior concentração de etanol, 45,3 g/L foi obtida com base nas condições sugeridas pelo modelo estatístico proposto. Essas condições foram temperatura de 38 °C, 16% (p/v) de resíduo celulósico de capim- elefante, 22,5 FPU do complexo enzimático Celluclast ® 1.5L/g de resíduo celulósico, agitação de 50 rpm e valor de pH de 4,8.Item Construction and phenotypic analysis of Kluyveromyces marxianus CCT 7735 recombinant flocculent strains for bioethanol production(Universidade Federal de Viçosa, 2015-07-29) Durán Meneses, Maria Fernanda; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://lattes.cnpq.br/9358825424062581Flocculent yeasts are used in industrial processes because is a simple and cost-effective strategy for cell recovery from fermentation mash. However, yeast only shows natural flocculent phenotype in extreme conditions, which makes it a complex phenotype. Here, we describe the construction of novel Kluyveromyces marxianus CCT 7735 strains expressing constitutive flocculent phenotype by linear DNA integration of FLO1, FLO5, FLO9 and FLO10 genes from Saccharomyces cerevisiae BY4700. All recombinant strains showed flocculation ability at 40°C and 45°C, K. marxianus CCT 7735 FLO1 and FLO9 strains showed similar ethanol production profile when compared to K. marxianus CCT 7735 wild type. These novel strains have special flocculent characteristics that provide an advantage over wild type for use in continuous ethanol fermentation systems at high temperatures.