Microbiologia Agrícola
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Item Assessment of ethanol tolerance of Kluyveromyces marxianus CCT 7735 selected by adaptive laboratory evolution(Universidade Federal de Viçosa, 2018-08-29) Silveira, Fernando Augusto da; Silveira, Wendel Batista da; http://lattes.cnpq.br/4876491797184708Whey is a by-product formed during the cheese-making, which presents lactose (4.5-5% w/v), soluble proteins, lipids, mineral salts and other components. It is the most abundant liquid waste generated in the dairy industries, which can lead to the pollution of water bodies due to its high biochemical oxygen demand and chemical oxygen demand. Whey permeate (WP) is a by-product constituted by lactose, produced from whey ultrafiltration. This way, WP can be converted by lactose-assimilating microorganisms, like yeasts, into value-added products. Kluyveromyces marxianus CCT 7735 has been showing a great potential for producing ethanol from lactose. However, its low ethanol tolerance is a drawback to be overcome, i. e., its growth is highly inhibited from 4% of ethanol (v/v). Adaptive laboratory evolution was used to select ethanol-tolerant K. marxianus CCT 7735 strains (ETSs). ETSs were grown under ethanol stress (4%, v/v) for long periods of time, over many generations (310-340 number of generations), in order to select the ethanol-tolerant phenotypes. From the determination of the physiological parameters, ETSs did not present alterations in their fermentative capacity, when compared their parental strains. However, ETS4 strain stood out for displaying a specific growth rate higher than the parental strain under ethanol stress (above 100%) and a specific ethanol production rate superior to all strains evaluated in this work. The metabolomic and fatty acids analysis were carried out with both ETS4 and parental strains to gain insights into the mechanisms related to the acquisition of ethanol tolerance. The accumulation of some amino acids (glutamate, alanine, valine, proline, and leucine) and metabolites of the citric acid cycle (isocitric acid, citric acid, cis-aconitic acid and malic acid) in ETS4 was found to be associated with the acquisition of ethanol tolerance. Furthermore, high fatty acids content and ergosterol in ETS4 compared to the parental strain indicate differences in their plasma membrane composition, which is consistent with metabolite leakage observed in the parental strain. Therefore, the accumulation of amino acids and citric acid cycle metabolites, as well as the alteration in the fatty acid and ergosterol contents contributed to the acquisition of ethanol tolerance in K. marxianus.Item Análise da influência da glicose sobre o metabolismo de xilose em Spathaspora passalidarum(Universidade Federal de Viçosa, 2017-07-24) Ribeiro, Lílian Emídio; Fietto, Luciano Gomes; http://lattes.cnpq.br/6586895168745187A levedura Spathaspora passalidarum converte de maneira eficiente xilose a etanol, se destacando para fermentação de hidrolisados lignocelulósicos. Possui uma cópia adicional do gene que codifica a enzima xilose redutase (XYL 1.2) com preferência pelo cofator NADH, permitindo o estabelecimento do equilíbrio redox durante o metabolismo de xilose. O objetivo deste trabalho foi analisar como a glicose influencia a fermentação de xilose por S. passalidarum. A avaliação do crescimento em meio contendo xilose e 2-DOG revelou que S. passalidarum não possui repressão por glicose no metabolismo de xilose. Foram feitos ensaios fermentativos em batelada com xilose e/ou glicose em aerobiose e hipoxia, para avaliação dos parâmetros cinéticos de fermentação e crescimento. S. passalidarum apresentou maiores rendimentos de biomassa no cultivo em glicose comparado ao cultivo em xilose nas duas condições de oxigênio. O melhor rendimento e produtividade de etanol foram encontrados no cultivo em xilose em aerobiose (Y (P/S) = 0,45 g/g e Qp= 1,51 g/L.h). A mistura de açúcares, glicose e xilose não interfere nos rendimentos ou produtividades de etanol, visto que foram similares aos encontrados durante a fermentação de xilose. O perfil de consumo dos açúcares em cofermentação foi diferente nas duas condições de oxigênio. As análises da expressão dos genes que codificam as enzimas do metabolismo de xilose (XR, XDH e XK) por qRT-PCR revelaram que esses genes são induzidos por xilose e não são reprimidos por glicose. Os dois genes que codificam a enzima xilose redutase (XR) em S. passalidarum apresentaram perfil de expressão diferente em xilose e cofermentação. No cultivo em xilose (aerobiose e hipoxia) e cofermentação em aerobiose, o gene XYL 1.2 foi mais expresso do que o gene XYL 1.1. Entretanto, no cultivo em cofermentação em hipoxia o gene XYL 1.1 foi mais expresso do que o gene XYL 1.2, sugerindo que a expressão destes genes pode ser controlada pelo estado redox da célula. Dessa forma, o consumo simultâneo ou não dos açúcares glicose e xilose em diferentes condições de oxigênio por S. passalidarum, não é uma questão de repressão da glicose na síntese das enzimas do metabolismo de xilose, e sim uma adaptação fisiológica da célula para estabelecer o equilíbrio redox.Item Produção de etanol em permeado de soro de queijo por Kluyveromyces marxianus UFV-3(Universidade Federal de Viçosa, 2004-02-16) Silveira, Wendel Batista da; Passos, Flávia Maria Lopes; http://lattes.cnpq.br/7361036485940798Com o objetivo de estabelecer a condição fisiológica para a conversão máxima da lactose do permeado de soro de queijo em etanol, avaliaram-se os efeitos da concentração de substrato e do nível de oxigênio no direcionamento do fluxo metabólico para a via fermentativa da levedura K. marxianus UFV-3. Inicialmente, as fermentações foram conduzidas em meio YNB sintético com altas concentrações de lactose, em condições aeróbica e microaeróbica (injeção de nitrogênio gasoso por 12 minutos), em regime de batelada. Nas fermentações sob microaerobiose, os rendimentos máximos de etanol por substrato foram próximos a 85% do rendimento teórico, ou seja, superiores aos obtidos em aerobiose, por volta de 55% desse rendimento. O rendimento de etanol máximo por massa celular também foi maior em microaerobiose, sendo a produtividade volumétrica maior em microaerobiose apenas na fermentação, cuja concentração inicial de lactose foi de 67,0 g L -1 . As fermentações realizadas em permeado de soro de queijo com 10 diferentes concentrações de lactose, que variaram de 1,0 g L -1 a 240,0 g L -1 , em regime de batelada, sob condições aeróbica, microaeróbica e anaeróbica (injeção de nitrogênio gasoso por todo o tempo de fermentação), apresentaram rendimento máximo de etanol por substrato e por massa celular, bem como de produtividade máxima volumétrica, superior àqueles obtidos em YNB. Além disso, K. marxianus UFV- 3 exibiu maiores velocidades específicas de crescimento, maior produção de massa celular e maior produção de glicerol nas fermentações em permeado que naquelas em YNB. Os parâmetros fermentativos da produção de etanol em permeado foram maiores em microaerobiose e anaerobiose do que em aerobiose. As fermentações em permeado – cujas concentrações iniciais de lactose foram acima de 50 g L -1 – e o nível de oxigênio reduzido (microaerobiose e anaerobiose) apresentaram altos rendimentos máximos de etanol por substrato, correspondendo a quase 100% do teórico. A velocidade de consumo de lactose e de produção de etanol aumentou à medida que a concentração inicial de substrato também aumentou e o nível de oxigênio diminuiu. A tolerância do produto (etanol) foi verificada no permeado acrescido de etanol, em concentrações que variaram de 5 a 80 g L -1 . Em 50 gL -1 , K. marxianus UFV-3 manteve um crescimento próximo a 80% em relação ao controle em condição anaeróbica e perto de 60% sob condições microaeróbica e aeróbioca.Item Genômica comparativa de leveduras de interesse biotecnológico(Universidade Federal de Viçosa, 2015-07-31) Costa, Daniela Arruda; Fietto, Luciano Gomes; http://lattes.cnpq.br/5119247632834494O advento das tecnologias de sequenciamento de nova geração possibilitou avanços significativos no campo do conhecimento dos genomas dos organismos. Com a redução dos custos de sequenciamento e aumento na rapidez do processamento das amostras, o número de genomas sequenciados e disponíveis em bancos de dados cresceu exponencialmente. Paralelamente, ocorreu um aumento na propagação de erros associados à anotação das sequências, que gera um impacto negativo em pesquisas posteriores baseadas nestes dados. A revisão da anotação e a comparação entre as informações disponíveis em bancos de dados públicos com experimentos de validação oferece uma alternativa para a correção desses erros. Neste contexto, este trabalho realizou a re- anotação e padronização de 14 genomas de leveduras de interese biotecnológico e disponíveis em bancos de dados públicos. Para facilitar a análise, os genomas foram separados em dois grupos: o grupo 1 (11 linhagens de Saccharomyces cerevisiae) e o grupo 2 (3 espécies de Kluyveromyces). Após a re-anotação, os proteomas preditos foram submetidos ao algoritmo de agrupamento OrthoMCL, para identificação de grupos de ortólogos e parálogos. As sequências ortólogas desses organismos, juntamente com comparações por similaridade com o banco de dados NR e com o banco de domínios conservados CDD, possibilitou a criação de bancos de dados locais com uma grande riqueza de informações, como link de acesso para os resultados do BLAST . Análise dos dados dos genomas permitiu a comparação da família de proteínas álcool desidrogenase (ADH) dentro dos grupos. Na linhagem S. cerevisiae JAY 291 não foi possível identificar o gene ADH7. Adicionalmente, o grupo 2 não possui sequências similares ao ADH5.Item Produção de etanol em biomassa de capim-elefante por Kluyveromyces marxianus CCT 7735(Universidade Federal de Viçosa, 2015-07-27) Campos, Breno Barcellos; Silveira, Wendel Batista da; http://lattes.cnpq.br/8786438627267312O capim-elefante é uma gramínea de elevada produtividade, que apresenta grande potencial para ser utilizado como biomassa lignocelulósica para a produção de etanol de segunda geração. A levedura Kluyveromyces marxianus vem se destacando na produção de etanol celulósico em processos de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) por ser termotolerante, além de produzir outros metabólitos de interesse industrial. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi estabelecer as condições ótimas de produção de etanol por Kluyveromyces marxianus CCT 7735 por meio do processo SSF. O capim- elefante foi pré-tratado com ácido diluído e com solução alcalina e, em seguida, o resíduo celulósico obtido foi submetido a uma pré-sacarificação durante 72 horas, seguido por 120 horas de SSF. Foram avaliados o efeito de cinco variáveis: temperatura, pH, agitação, concentrações de enzimas e de resíduo celulósico de capim-elefante (biomassa) durante 120 horas de SSF. Os resultados mostraram que a levedura termotolerante K. marxianus CCT 7735 produziu etanol nos tratamentos realizados a 45 °C, temperatura próxima à ótima para a atividade das enzimas celulolíticas. A concentração de biomassa, temperatura e concentração do complexo enzimático tiveram efeito significativo (p valor < 0,05) no processo. A maior concentração de etanol, 45,3 g/L foi obtida com base nas condições sugeridas pelo modelo estatístico proposto. Essas condições foram temperatura de 38 °C, 16% (p/v) de resíduo celulósico de capim- elefante, 22,5 FPU do complexo enzimático Celluclast ® 1.5L/g de resíduo celulósico, agitação de 50 rpm e valor de pH de 4,8.Item Construction and phenotypic analysis of Kluyveromyces marxianus CCT 7735 recombinant flocculent strains for bioethanol production(Universidade Federal de Viçosa, 2015-07-29) Durán Meneses, Maria Fernanda; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://lattes.cnpq.br/9358825424062581Flocculent yeasts are used in industrial processes because is a simple and cost-effective strategy for cell recovery from fermentation mash. However, yeast only shows natural flocculent phenotype in extreme conditions, which makes it a complex phenotype. Here, we describe the construction of novel Kluyveromyces marxianus CCT 7735 strains expressing constitutive flocculent phenotype by linear DNA integration of FLO1, FLO5, FLO9 and FLO10 genes from Saccharomyces cerevisiae BY4700. All recombinant strains showed flocculation ability at 40°C and 45°C, K. marxianus CCT 7735 FLO1 and FLO9 strains showed similar ethanol production profile when compared to K. marxianus CCT 7735 wild type. These novel strains have special flocculent characteristics that provide an advantage over wild type for use in continuous ethanol fermentation systems at high temperatures.