Microbiologia Agrícola
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Item Análise in silico e caracterização funcional de RNAs pequenos reguladores: alvos e fenótipos envolvidos em Actinobacillus pleuropneumoniae(Universidade Federal de Viçosa, 2018-09-06) Sanches, Newton Moreno; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://lattes.cnpq.br/8446507970942803Actinobacillus pleuropneumoniae (App) é o agente causal da pleuropneumonia suína, doença que causa uma pleuropneumonia fibrinosa, exsudativa, hemorrágica, necrosante, que afeta porcos de todas as idades, levando à morte súbita e grandes perdas econômicas em todo o mundo. Existem dois métodos básicos para limitar a infecção endêmica de App: antibióticos e vacinas, mas a segunda opção não é eficiente para controlar a pleuropneumonia porcina. A virulência de App é complexa e envolve diferentes fatores bacterianos que incluem exotoxinas, polissacarídeos capsulares e lipopolissacarídeos. Além disso, existem fatores adicionais de virulência que são up- ou down-regulados durante a infecção e pequenos RNAs reguladores (sRNAs) podem regulá-los. Recentemente, nosso grupo identificou 23 sRNAs em App, cuja transcrição foi validada por RNA-Seq. Neste trabalho selecionamos seis genes sRNA e produzimos mutantes de deleção a partir dos parentais selvagem (WT_ΔsRNA) e de seu mutante isogênico para a chaperona de sRNAs, Hfq (Δhfq_ΔsRNA). Além disso, propomos uma análise robusta in silico da estrutura, conservação e interação dos RNAs de App com seus alvos. Os fenótipos desses mutantes foram comparados aos da linhagem parental sob diferentes condições, como: curva de crescimento, crescimento sob diferentes condições de estresse, determinação da concentração inibitória mínima contra antibióticos, adesão em superfícies bióticas e abióticas, atividade hemolítica e virulência no modelo alternativo de infecção, Galleria mellonella. As linhagens ΔsRNA exibiram uma diferença fenotípica em relação às linhagens parentais sob pelo menos uma condição, revelando que os sRNAs de App estão envolvidos na regulação da virulência. Notavelmente, alguns mutantes de deleção simples mostraram um fenótipo de ganho de função, que ainda não foi descrito para nenhum outro mutante de deleção de gene de sRNA na família Pasteurellaceae. Além disso, um mutante mostrou uma forte atenuação de virulência, sendo um candidato para elaboração de uma vacina viva atenuada contra A. pleuropneumoniae. As análises in silico revelaram a presença de sRNAs de App em seis gêneros da família Pasteurellaceae. Vários alvos foram encontrados e categorizados em diferentes funções, evidenciando uma complexa rede de regulação gênica para esses RNAs. A partir desses resultados, propomos um modelo de ação via Arrc14 em que ele atua como regulador negativo no metabolismo de amino e nucleotídeo açúcares. Nossos resultados permitem concluir que os sRNAs aqui estudados interferem de forma distinta na regulação da virulência de Actinobacillus pleuropneumoniae sorotipo 8. Concluímos ainda que, com base nos dados obtidos para RNA01, a linhagem WT_Δrna01 possui potencial para ser utilizada no desenvolvimento de uma vacina atenuada viva para prevenir e controlar infecções por Actinobacillus pleuropneumoniae.Item Caracterização e expressão da chaperona Hfq em Actinobacillus pleuropneumoniae, o agente causal da pleuropneumonia suína(Universidade Federal de Viçosa, 2016-02-29) Silva, Thyara Ferreira da; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://lattes.cnpq.br/0606351815747290Infecções que acometem o trato respiratório de suínos levam a significativas perdas econômicas na suinocultura mundial. Um dos principais patógenos respiratórios em suínos é a bactéria Actinobacillus pleuropneumoniae, o principal agente causal da pleuropneumonia. Atualmente podem ser encontrados 16 sorotipos de A. pleuropneumoniae com virulência distinta e complexa, sendo os principais fatores de virulência: exotoxinas Apx, lipopolissacarídeo (LPS), cápsula e a capacidade de formação de biofilme. O controle da doença é baseado no uso de antibióticos e cuidados no manejo da granja. A profilaxia pela imunização passiva ainda é ineficiente devido à dificuldade na obtenção de uma vacina contra todos os sorotipos encontrados. Assim, novas abordagens experimentais na elaboração de uma vacina eficiente associada a uma resposta imune protetora são essenciais porque podem representar novas alternativas na estratégia de controle da doença. A proteína Hfq é um componente central de regulação global pós-transcricional e participa diretamente na regulação da expressão de genes por facilitar a interação de RNAs pequenos com mRNAs alvos, sendo esta uma abordagem atual e relacionada ao controle da virulência em diversas bactérias patogênicas. Neste sentido, o estudo da chaperona de RNA Hfq é de extrema importância, uma vez que já foi demonstrado seu efeito pleiotrópico e impacto na virulência, na resposta a diferentes tipos de estresse e no crescimento celular de vários patógenos, incluindo A. pleuropneumoniae. Portanto, esse trabalho teve como objetivos: caracterizar in silico a proteína Hfq em A. pleuropneumoniae e analisar a expressão e a fase de maior abundância desta proteína ao longo do crescimento de A. pleuropneumoniae. As análises filogenéticas realizadas foram baseadas em análises de comparação de sequências de aminoácidos da proteína Hfq de diferentes membros da classe Gammaproteobacteria, na qual A. pleuropneumoniae está inserida. As demais análises foram conduzidas utilizando os sorotipos 1, 8 e 15 de A. pleuropneumoniae, sendo utilizadas as linhagens do tipo selvagem (WT) e hfq::3XFLAG. O alinhamento de sequências da proteína Hfq revelou uma identidade de 98% entre as proteínas Hfq de A. pleuropneumoniae de diferentes sorotipos, além de demonstar que Hfq de espécies de uma mesma família possuem maior relação filogenética. A análise da estrutura tridimensional da proteína em A. pleuropneumoniae demonstrou a presença de estruturas características da proteína presente em outos patógenos Gram-negativos, como uma α-hélice e folhas β. A análise da velocidade específica de crescimento por ANOVA entre as linhagens WT e hfq::3XFLAG do mesmo sorotipo revelou que não há diferença de crescimento entre essas linhagens do mesmo sorotipo. Quanto à expressão de Hfq, foi detectado um maior acúmulo da proteína na fase estacionária de crescimento, no período de 6-8 horas, dependendo do sorotipo investigado, e que a expressão de Hfq foi diferencial entre os sorotipos analisados. Esses resultados revelaram que a proteína Hfq é conservada entre os sorotipos de A. pleuropneumoniae e possui estrutura tridimensional característica. Além disso, a inserção da etiqueta FLAG em Hfq não alterou o perfil de crescimento celular e hà um maior acúmulo da proteína na fase estacionária de crescimento, sendo que os sorotipos apresentaram distribuição das formas diferencial entre os sorotipos e dinâmica de acordo com a fase de crescimento. Essa diferença pode estar relacionada aos diferentes perfis de virulência e de resposta a diferentes condições investigadas previamente, uma vez que a abundância nestes sorotipos apresentou distribuição temporal distinta.Item Análise genômica e determinação do proteoma referência de isolados clínicos de Actinobacillus pleuropneumoniae sorotipo 8(Universidade Federal de Viçosa, 2016-02-22) Prado, Isabelle Gonçalves de Oliveira; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://lattes.cnpq.br/3640365647553917Actinobacillus pleuropneumoniae é o agente etiológico da pleuropneumonia suína, uma doença respiratória severa que resulta em significantes perdas econômicas no setor da suinocultura. Atualmente, A. pleuropneumoniae é classificado em 16 sorotipos diferentes que podem causar a doença com virulência distinta entre eles. Em Minas Gerais, Brasil, A. pleuropneumoniae é encontrado nas granjas e a maior distribuição é do sorotipo 8, sendo este até pouco tempo negligenciado em estudos de epidemiologia devido a problemas de identificação. Da mesma forma, atualmente é aceito que este sorotipo é também o de maior distribuição nos Estados Unidos, Canadá, Reino Unido além do Brasil. Até recentemente, não havia disponibilidade de genomas de A. pleuropneumoniae sorotipo 8 em banco de dados, por isso não existem informações genômicas específicas para este sorotipo, especialmente provenientes de isolados clínicos recentemente circulantes nas granjas. Neste contexto, somente a partir de 2015 os primeiros genomas foram disponibilizados para serem analisados, sendo assim sete genomas de isolados clínicos de A. pleuropneumoniae sorotipo 8 estão hoje disponíveis e estes foram analisados neste estudo. A partir das sequências genômicas dos isolados clínicos de A. pleuropneumoniae sorotipo 8 foi proposto um modelo de proteoma referência desse sorotipo com um total de 2.396 proteínas categorizadas nas diferentes classes de grupos de ortólogos. Na análise comparativa realizada entre genomas de A. pleuropneumoniae sorotipo 8 e demais sorotipos foi observado um padrão de conservação na organização do genoma entre esses. No entanto, foram identificadas algumas diferenças pontuais e dois segmentos genômicos diferenciais entre os genomas analisados com rearranjos e /ou inversões de 42,2 Kb e 59,6 Kb. O primeiro segmento foi encontrado nos genomas dos sorotipos 5 (L20), 7 (AP76) e em quatro dos isolados clínicos do sorotipo 8 investigados, sendo eles MV518, MV780, MV1022 e MV5651 contendo sequências de profago. O segundo segmento diferencial foi identificado apenas no genoma de A. pleuropneumoniae sorotipo 7 (AP76) e contém sequências como transposases caracterizando a presença de uma sequência de inserção no segmento. De acordo com a análise dos códons preferenciais de todos os sorotipos investigados, não foram observadas diferenças marcantes entre eles. Na análise comparativa dos proteomas, a maioria das sequências do proteoma referência de A. pleuropneumoniae sorotipo 8 que apresentaram baixa similaridade com os demais sorotipos foram caracterizadas como hipotéticas, não tendo sua função conhecida. Nessa porção diferencial específica foram relatadas sequências codificadoras relacionadas à plasmídeos o que caracteriza possíveis eventos de transferência horizontal de genes (THG) ao longo da história evolutiva do genoma e fatores de resistência a antibióticos como cloranfenicol, sulfonamida e tetraciclina. Na análise de similaridade entre os proteomas houve maior similaridade das proteínas do proteoma referência do sorotipo 8 com as proteínas do sorotipo 6, o que pode estar associado à dificuldade em separar esses sorotipos nas técnicas de sorotipagem. Com as análises comparativas e a caracterização das diferenças entre os sorotipos e isolados será possível compreender os mecanismos de virulência dos isolados de A. pleuropneumoniae e identificar potenciais candidatos vacinais mais eficientes.Item Uso de Galleria mellonella como modelo de infecção e estudo de fatores relacionados com a virulência de Actinobacillus pleuropneumoniae(Universidade Federal de Viçosa, 2015-02-24) Pereira, Monalessa Fábia; Bazzolli, Denise Mara Soares; http://lattes.cnpq.br/3280341431428908Actinobacillus pleuropneumoniae é o agente etiológico da pleuropneumonia suína, uma severa enfermidade que acomete suínos de todas as idades, gerando perdas econômicas significativas para a suinocultura mundial. Embora os 15 sorotipos conhecidos dessa bactéria possam causar a doença, existem diferenças marcantes de virulência entre eles. A virulência de A. pleuropneumoniae é multifatorial e está relacionada à composição e estrutura de polissacarídeos da cápsula, LPS, e toxinas da família RTX, além desses fatores, a aderência em forma de biofilme e a resistência a agentes antimicrobianos podem ser determinantes para virulência. Este trabalho estabeleceu um modelo de infecção alternativo para o estudo de A. pleuropneumoniae, utilizando larvas de Galleria mellonella e, posteriormente esse modelo foi usado para investigar a virulência de isolados clínicos de A. pleuropneumoniae sorotipo 8. Os mesmos isolados foram avaliados quanto ao potencial de formação de biofilme e resistência a antimicrobianos comumente empregados em campo. A partir dessas informações, isolados clínicos com diferenças significativas na virulência, no potencial de formação de biofilme e no perfil de resistência foram selecionados para o sequenciamento genômico. Os resultados mostraram que o modelo de infecção A. pleuropneumoniae – G. mellonella é capaz de diferenciar níveis de virulência de isolados clínicos de mesmo sorotipo, além de permitir a avaliação da eficiência de agentes antimicrobianos contra este patógeno. O modelo também mostrou eficiência para diferenciar virulência entre linhagens selvagem e mutante da mesma bactéria. Uma análise de correlação entre os dados de virulência, formação de biofilme e resistência a antimicrobianos permitiu que seis isolados fossem selecionados para o sequenciamento. Com a montagem e anotação foi possível verificar que os genomas de A. pleuropneumoniae sorotipo 8 apresentam tamanho de 2,2 ± 0,004 Mpb, com o conteúdo GC de 40,33% ± 0,263 e regiões codificadoras com uma média de tamanho de 817,3 ± 6,8 pb. As regiões codificadoras correspondem a 89,05% ± 0,13 do genoma, das quais a maior parte foi anotada como genes funcionais, o que permitirá a realização de estudos comparativos. Estes genomas apresentam em média 79,5 ± 24,05 genes exclusivos, revelando a alta variabilidade genética dessa espécie, que pode estar relacionada com a variação da virulência entre os isolados estudados.