Microbiologia Agrícola
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Item Influência do fago vB_EcoM-UFV13 no biofilme formado pelo consórcio P48SEP(Universidade Federal de Viçosa, 2019-07-04) Carmo, Adriele Jéssica do; Paula, Sérgio Oliveira de; http://lattes.cnpq.br/3568973204091382O controle da corrosão microbiologicamente induzida (MIC) é um desafio crescente no setor de exploração de petróleo e gás. A MIC é o resultado de uma série de reações eletroquímicas, influenciadas ou dirigidas por microrganismos, como as bactérias redutoras de sulfato (BRS), que se acumulam na superfície das tubulações formando os biofilmes, ocasionando grandes prejuízos econômicos. As BRS são microrganismos anaeróbios que utilizam sulfato como aceptor final de elétrons, levando a produção de sulfeto de hidrogênio, um produto altamente reativo, corrosivo e tóxico. A principal forma de controle das BRS atualmente, é a injeção de biocidas, no entanto, esses produtos químicos não conseguem penetrar na matriz do biofilme e alcançar os microrganismos presentes, além do mais, são caros, requerem a aplicação contínua, e podem levar à geração de bactérias resistentes, representam um risco para os seres humanos e o meio ambiente devido à sua toxicidade e a persistência nos resíduos industriais. Dessa forma, há a necessidade de desenvolver abordagens mais eficientes e específicas no controle do processo de biocorrosão no setor petrolífero. Neste trabalho, foi avaliado o potencial do fago vB_EcoM-UFV13 em três diferentes concentrações (baixa: 10 4 UFP/mL, média: 10 8 UFP/mL e alta: 10 12 UFP/mL) na prevenção da formação de biofilme em cupons de aço carbono pelo consórcio bacteriano P48SEP constituído por BRS isolado de água de produção obtida da exploração de petróleo. Através da microscopia eletrônica de varredura, análise da composição química do biofilme e contagem celular por meio de citometria de fluxo demostraram a capacidade do fago em média (10 8 UFP/mL) e alta (10 12 UFP/mL) concentração de prevenir a formação de biofilme desenvolvido pelo consórcio, diminuir as principais biomoléculas responsáveis pelo processo de adesão e estabilização do biofilme, e também reduzir o número de células vivas aderidas ao cupom. Além disso, a presença do vírus foi capaz de alterar o padrão de expressão gênica de genes relacionados à formação do biofilme e genes envolvidos na captura, transporte e armazenamento do ferro nas células, assim como, os níveis de abundância relativa de proteínas relacionadas à formação do biofilme e resposta celular ao estresse. Este estudo mostra pela primeira vez a capacidade de um bacteriófago de prevenir a formação de biofilme proveniente de BRS, sendo uma alternativa promissora para o controle da biocorrosão em oleodutos e tanques de armazenamentos de petróleo. Palavras-chaves: Fago. Bactérias redutoras de sulfato. Biocorrosão.Item Caracterização e otimização da produção do bacteriófago lítico vB_EcoM_UFV09(Universidade Federal de Viçosa, 2019-02-26) Silva, Jéssica Duarte da; Paula, Sérgio Oliveira de; http://lattes.cnpq.br/0374413607226322Bacteriófagos, ou fagos, são vírus que infectam bactérias. Logo após serem descritos, esses organismos já eram usados no tratamento contra bactérias patogênicas, o que chamamos de fagoterapia. Porém, com a descoberta da penicilina no final dos anos 30, a utilização dos bacteriófagos na clínica médica foi perdendo a força até ser praticamente esquecido. O recente aumento de cepas bacterianas resistentes à antibióticos fez com que a fagoterapia voltasse a surgir como alternativa no tratamento de doenças bacterianas. Outra importante aplicação dos bacteriófagos é contra os biofilmes bacterianos. Dentre as enzimas fágicas com importante potencial contra os biofilmes estão as hidrolases do tipo depolimerases, e as lisinas. Sendo assim, o estudo envolvendo bacteriófagos ultrapassa a aplicação médica e começa a ser considerado para contextos mais amplos, em escala ambiental. Uma das principais limitações do uso de bacteriófagos em sistemas ambientais é a quantidade exponencialmente maior de partículas virais do que se é produzido normalmente em laboratório. Estudos e metodologias que visam otimizar e tornar economicamente viável a produção de bacteriófagos em larga escala são de extrema importância e representam uma demanda crescente. Este trabalho teve como objetivo caracterizar de forma morfológica e genômica o fago vB_EcoM_UFV09, que foi isolado a partir de amostras de esgoto, utilizando-se uma estirpe de bactéria Escherichia coli como hospedeira e analisar seu potencial na fagoterapia. Além disso, foi avaliado o impacto dos parâmetros de cultivo: temperatura, tempo de incubação, agitação e Multiplicity of Infection (MOI), na produção viral, comparando-se os resultados obtidos em meio mínimo M9 suplementado com seis fontes de carbono diferentes (acetato, ácido lático, piruvato, glicerol, succinato e glicose) e em meio rico Luria Bertani (LB). Nossos resultados demonstraram que o isolado pertence à família Myoviridae, mais especificamente ao gênero T4. A ausência de genes de patogenicidade e de resistência à antibióticos no genoma do vB_EcoM_UFV09, assim como a lise obrigatória da célula bacteriana após a infecção viral, são características promissoras para a utilização desse fago no controle do crescimento de estirpes da bactéria Escherichia coli. Além disso, a avaliação do impacto das variáveis de cultivo na produção da progênie viral demonstrou que fontes de carbono como succinato, glicose e LB proporcionam condições fisiológicas mais estáveis para a produção fago vB_EcoM_UFV09 em larga escala.Item Atividade da proteína Gp16-43 de Ralstonia virus phiAP1 na inibição e degradação de biofilme bacteriano(Universidade Federal de Viçosa, 2019-02-27) Pereira, Bruna Maria Magro; Zerbini, Poliane Alfenas; http://lattes.cnpq.br/1699435614313133Os vírus que infectam bactérias (bacteriófagos) são os organismos mais abundantes do planeta, e desempenham importantes funções para a manutenção do ecossistema. Nos últimos anos, o uso de vírus como ferramenta de controle biológico tem ganhado bastante atenção, devido, principalmente, à dificuldade de se isolar novas drogas antimicrobianas e à seleção de bactérias resistentes às drogas já existentes. Devido a esse potencial como agentes de controle biológico, as descobertas sobre esses vírus têm aumentado o que amplia as perspectivas de controle de doenças. O biofilme bacteriano representa um importante fator de virulência em bactérias patogênicas. A matriz de exopolímeros presente no biofilme confere limitação à penetração de agentes antimicrobianos e aumenta a tolerância às defesas do hospedeiro, dificultando o controle de bactérias patogênicas produtoras de biofilme. Os bacteriófagos codificam proteínas associadas à lise celular com interessante aplicação no controle desses microrganismos. As despolimerases virais são uma classe de proteínas que desempenham um papel importante no processo de infecção do vírus em seu hospedeiro, atuando na matriz exopolissacarídea do biofilme bacteriano para permitir uma infecção viral eficiente. Desta forma, tem sido apontada como sendo um interessante agente de inibição e/ou degradação do biofilme de bactérias patogênicas. Este estudo traz a caracterização da atividade de uma nova despolimerase associada ao vírion (Gp16-43) codificada pelo vírus Ralstonia virus phiAP1. Gp16-43 foi eficiente para inibir a formação do biofilme de E. coli, R. pseudosolanacearum e S. aureus. Baixas concentrações de proteínas (250- 500 µg/mL) já foram capazes de reduzir a formação de biofilme dessas bactérias. A proteína Gp16-43 foi capaz de degradar o biofilme formado de E. coli e R. pseudosolanacearum, sendo mais eficiente na concentração de 1375 µg/mL, mas não no biofilme de S. aureus. Com base nesses resultados, a Gp16-43, uma nova exopolissacarídeo-despolimerase derivada de vírus, representa uma nova estratégia de grande potencial biotecnológico para prevenir e degradar a formação de biofilme de microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos.Item Caracterização genômica de profagos e de bactérias do gênero Desulfovibrio(Universidade Federal de Viçosa, 2018-07-16) Crispim, Josicelli Souza; Paula, Sérgio Oliveira de; http://lattes.cnpq.br/5230945928388455Bactérias do gênero Desulfovibrio pertencem ao grupo de Bactérias Redutoras de Sulfato (BRS). As BRS causam significativos prejuízos à indústria de petróleo, principalmente devido à capacidade de causar corrosão microbiologicamente induzida, formação de biofilme e produção de H2S. Bacteriófagos são uma forma alternativa para o controle biológico das BRS, cuja informação para este grupo de bactérias, entretanto, é escassa. Assim, este trabalho teve como objetivos: 1) identificar e caracterizar profagos em genomas de Desulfovibrio; 2) verificar a expressão de profagos de Desulfovibrio alaskensis; 3) Isolar, sequenciar e montar genomas de BRS. Para identificação de profagos de Desulfovibrio foram utilizados 46 genomas depositados em banco de dados. 53 profagos completos foram identificados em 46 dos genomas analisados. Estes foram classificados dentro da ordem Caudovirales, com 69,82% pertencentes à família Myoviridae. 18 profagos identificados possuem genes que codificam para lisozima e holina. Quatro dos genomas analisados apresentam profagos com identidade acima de 50% na mesma linhagem, cuja análise comparativa demonstrou a existência de colinearidade entre as sequências. Dos 17 genomas bacterianos fechados analisados, 6 possuem sistema CRISPR-Cas classificado como inativo. A identificação da poli-lisogenia, a proximidade entre os profagos completos e a possível inatividade do CRISPR-Cas nos genomas fechados analisados, permitiu a escolha de linhagens poli-lisogênicas com profagos pertencentes à família Myoviridae para isolamento de profagos e testes em linhagens relacionadas para estudos posteriores. A linhagem D. alaskensis DSM16109 possui três profagos, cuja a expressão e a relação com vesículas de membrana externa foram verificados neste trabalho. A linhagem DSM16109 apresentou menor crescimento após a adição de mitomicina C em relação à cultura controle. Esta redução foi acompanhada da presença de partículas virus-like (VLPs), indicando indução de profagos por mitomicina C. Foi verificado o aumento do número de cópias dos genes cap dos três profagos e transcrição dos mesmos na amostra controle, entretanto, sem a formação de VLPs. Genes de profagos foram identificados em vesículas de membrana externa de culturas tratadas e não tratadas com mitomicina C. Os profagos de DSM16109 são induzidos de forma espontânea, mas, apenas a presença de mitomicina C levou à formação de VLPs. O material genético dos profagos detectado dentro de vesículas de membrana externa podem estar relacionados com a transferência horizontal de genes virais. Nas análises genômicas de isolados de amostras de plataformas de extração de petróleo da Bacia de Campos (RJ) foi verificado que a linhagem P37SLT pertence à espécie Desulfovibrio indonesiensis com 4,2Mb e a linhagem P48SEP pertence à espécie Desulfovibrio marinus com 5,1Mb. Ambas as linhagens foram sequenciadas pelo sistema HiSeq (2x300) e apresentam sequências relacionadas à profagos, uma característica comum do gênero Desulfovibrio encontrada nos genomas anteriormente analisados.Item Uso do bacteriófago vB_EcoM-UFV13 como potencial agente antimastítico em vacas leiteiras(Universidade Federal de Viçosa, 2018-04-26) Duarte, Vinícius da Silva; Paula, Sérgio Oliveira de; http://lattes.cnpq.br/7814802722636291A atividade leiteira no Brasil sofreu profundas transformações nos últimos anos no que diz respeito, principalmente, ao aumento da produtividade com um custo de produção cada vez menor. Para que tal resultado seja alcançado, o animal é invariavelmente desafiado a atender altos índices zootécnico. Dentro do manejo sanitário, a mastite bovina ainda é a principal causa de perdas econômicas para produtores de leite, estimado em $ 533 bilhões de dólares em todo o mundo. A Escherichia coli é responsável pela maioria dos casos de mastite ambiental (40%), enquanto que Trueperella pyogenes é um dos principais agentes causadores de mastite em novilhas no período seco. Embora a terapia com antimicrobianos convencionais seja a mais utilizada nos rebanhos, o uso de bacteriófagos como instrumento no controle de patógenos na Veterinária tem ganhado destaque. Neste trabalho, buscamos avaliar o uso do bacteriófago vB_EcoM-UFV13 (UFV13) contra estes dois importantes patógenos causadores de mastite bovina. Em um primeiro estudo, investigamos o uso do fago UFV13 na prevenção da formação do biofilme de T. pyogenes, um dos principais fatores de virulência apresentado por este micro-organismo. Empregando-se duas diferentes metodologias (cristal violeta e contagem de células sésseis), observou-se que somente a multiplicidade de infecção 10 apresentou redução, estatisticamente significativa, do biofilme formado. A análise das proteínas estruturais do vírus UFV13 revelou um repertório de proteínas com domínio hidrolase (Virion-Associated Peptidoglycan Hydrolases – VAPGHs) que potencialmente estão envolvidas no processo de adesão e desenvolvimento do biofilme. No segundo estudo, examinamos o fago UFV13 em termos genômico, a sua estabilidade em diferentes condições adversas, além da sua atividade contra E. coli em camundongos fêmeas lactantes. Estas análises revelaram que o vírus UFV13 é oriundo de uma recente infecção mista com Shigella phage Shfl2. Além disto, sua administração intramamária provocou uma redução de 10 vezes na carga bacteriana total, além de induzir a produção de citocinas pró-inflamatórias como IL-6 e TNF-α. Após esses estudos, a completa caracterização do fago UFV13 o torna um possível candidato para controle da mastite bovina no gado leiteiro.Item Caracterização molecular de um vírus com genoma de DNA que infecta Ralstonia solanacearum e caracterização de proteínas H-NS e sua função na regulação do sistema CRISPR-CAS(Universidade Federal de Viçosa, 2017-02-24) Almeida, Juliana Cristina Fraleon de; Zerbini, Poliane Alfenas; http://lattes.cnpq.br/7086745067874322Os vírus que infectam bactérias são os organismos mais abundantes do planeta, e desempenham importantes funções para a manutenção do ecossistema. Nos últimos anos, o uso de vírus como ferramenta de controle biológico tem ganhado bastante atenção, devido, principalmente, à dificuldade de se isolar novas drogas antimicrobianas e à seleção de bactérias resistentes às drogas já existentes. Devido a esse potencial como agentes de controle biológico, as descobertas sobre esses vírus tem aumentado o que amplia as perspectivas do manejo ecológico de doenças em plantas. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivos i) caracterizar um bacteriófago isolado de Ralstonia solanacearum proveniente do estado do Ceará, Brasil ii) caracterizar proteínas H-NS de Ralstonia solanacearum e estudar seu o efeito regulatório no sistema CRISPR-Cas. A partir de um isolado não patogênico de Ralstonia solanacearum, foi isolado um vírus filamentoso que possui um ciclo de multiplicação do tipo pseudo-lisogênico. O genoma viral foi completamente sequenciado, possui 6945 nucleotídeos e conteúdo de GC de 61,25%. A organização genômica é típica de vírus da família Inoviridae, gênero Inovirus. Comparação da sequência obtida com sequências de outros Inovirus sugere que o isolado viral é uma nova espécie do grupo φRSM, tentativamente denominada Ralstonia solanacearum Inovirus Brazil 1 (RSIBR1). Partículas de RSIBR1 foram transmitidas para R. pseudosolanacearum, que quando infectadas pelo RSIBR1 também perdeu a capacidade de causar doença em plantas de tomate, sugerindo que a infecção viral interfere com a patogenicidade de Ralstonia spp. Em estudos anteriores, foi demonstrado que o sistema CRISPR-Cas de Ralstonia solanacearum é inativo. Para avaliar se essa inatividade pode ser explicada pela presença de proteínas do tipo H-NS,foi realizada uma busca por genes que codificam H-NS no genoma de Ralstonia solanacearum. Três cópias de H-NS (H-NS 1, 2 e 3) foram localizadas no megaplasmídeo. Não foram identificadas cópias de H-NS codificadas no cromossomo bacteriano. As H-NS de Ralstonia solanacearum possuem os domínios de oligomerização e de ligação a DNA bem conservados. A análise filogenética de proteínas H-NS de diferentes bactérias agruparam de acordo com as famílias Enterobacteriaceae,Pseudomonadaceae e Ralstoniaceae. Além disso, foi observado que as proteínas H-NS da família Ralstoniaceae são altamente conservadas com H-NS codificadas por podovírus, sugerindo que as H-NS de Ralstoniaceae podem ser de origem viral. Foi realizada uma análise in silico nos promotores das proteínas CAS para verificar a presença de sítios de ligação de H-NS. Foram identificadas regiões de alto conteúdo AT, com curvatura típica potencial para a ligação de H-NS. A análise da expressão das H-NS mostrou que somente as H-NS 1 e 3 são expressas em Ralstonia solanacearum. Para confirmar que as proteínas H-NS possuem efeito regulatório na expressão dos genes Cas, foram construídos cassetes para a obtenção de mutantes para H-NS1, H-NS 2 e H-NS3. A obtenção dos mutantes e a análise da expressão dos genes Cas nos mutantes irão permitir elucidar o papel regulatório de H-NS na expressão do sistema CRISPR-Cas em Ralstonia solanacearum.