Microbiologia Agrícola
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Item Influência do fago vB_EcoM-UFV13 no biofilme formado pelo consórcio P48SEP(Universidade Federal de Viçosa, 2019-07-04) Carmo, Adriele Jéssica do; Paula, Sérgio Oliveira de; http://lattes.cnpq.br/3568973204091382O controle da corrosão microbiologicamente induzida (MIC) é um desafio crescente no setor de exploração de petróleo e gás. A MIC é o resultado de uma série de reações eletroquímicas, influenciadas ou dirigidas por microrganismos, como as bactérias redutoras de sulfato (BRS), que se acumulam na superfície das tubulações formando os biofilmes, ocasionando grandes prejuízos econômicos. As BRS são microrganismos anaeróbios que utilizam sulfato como aceptor final de elétrons, levando a produção de sulfeto de hidrogênio, um produto altamente reativo, corrosivo e tóxico. A principal forma de controle das BRS atualmente, é a injeção de biocidas, no entanto, esses produtos químicos não conseguem penetrar na matriz do biofilme e alcançar os microrganismos presentes, além do mais, são caros, requerem a aplicação contínua, e podem levar à geração de bactérias resistentes, representam um risco para os seres humanos e o meio ambiente devido à sua toxicidade e a persistência nos resíduos industriais. Dessa forma, há a necessidade de desenvolver abordagens mais eficientes e específicas no controle do processo de biocorrosão no setor petrolífero. Neste trabalho, foi avaliado o potencial do fago vB_EcoM-UFV13 em três diferentes concentrações (baixa: 10 4 UFP/mL, média: 10 8 UFP/mL e alta: 10 12 UFP/mL) na prevenção da formação de biofilme em cupons de aço carbono pelo consórcio bacteriano P48SEP constituído por BRS isolado de água de produção obtida da exploração de petróleo. Através da microscopia eletrônica de varredura, análise da composição química do biofilme e contagem celular por meio de citometria de fluxo demostraram a capacidade do fago em média (10 8 UFP/mL) e alta (10 12 UFP/mL) concentração de prevenir a formação de biofilme desenvolvido pelo consórcio, diminuir as principais biomoléculas responsáveis pelo processo de adesão e estabilização do biofilme, e também reduzir o número de células vivas aderidas ao cupom. Além disso, a presença do vírus foi capaz de alterar o padrão de expressão gênica de genes relacionados à formação do biofilme e genes envolvidos na captura, transporte e armazenamento do ferro nas células, assim como, os níveis de abundância relativa de proteínas relacionadas à formação do biofilme e resposta celular ao estresse. Este estudo mostra pela primeira vez a capacidade de um bacteriófago de prevenir a formação de biofilme proveniente de BRS, sendo uma alternativa promissora para o controle da biocorrosão em oleodutos e tanques de armazenamentos de petróleo. Palavras-chaves: Fago. Bactérias redutoras de sulfato. Biocorrosão.Item Caracterização e otimização da produção do bacteriófago lítico vB_EcoM_UFV09(Universidade Federal de Viçosa, 2019-02-26) Silva, Jéssica Duarte da; Paula, Sérgio Oliveira de; http://lattes.cnpq.br/0374413607226322Bacteriófagos, ou fagos, são vírus que infectam bactérias. Logo após serem descritos, esses organismos já eram usados no tratamento contra bactérias patogênicas, o que chamamos de fagoterapia. Porém, com a descoberta da penicilina no final dos anos 30, a utilização dos bacteriófagos na clínica médica foi perdendo a força até ser praticamente esquecido. O recente aumento de cepas bacterianas resistentes à antibióticos fez com que a fagoterapia voltasse a surgir como alternativa no tratamento de doenças bacterianas. Outra importante aplicação dos bacteriófagos é contra os biofilmes bacterianos. Dentre as enzimas fágicas com importante potencial contra os biofilmes estão as hidrolases do tipo depolimerases, e as lisinas. Sendo assim, o estudo envolvendo bacteriófagos ultrapassa a aplicação médica e começa a ser considerado para contextos mais amplos, em escala ambiental. Uma das principais limitações do uso de bacteriófagos em sistemas ambientais é a quantidade exponencialmente maior de partículas virais do que se é produzido normalmente em laboratório. Estudos e metodologias que visam otimizar e tornar economicamente viável a produção de bacteriófagos em larga escala são de extrema importância e representam uma demanda crescente. Este trabalho teve como objetivo caracterizar de forma morfológica e genômica o fago vB_EcoM_UFV09, que foi isolado a partir de amostras de esgoto, utilizando-se uma estirpe de bactéria Escherichia coli como hospedeira e analisar seu potencial na fagoterapia. Além disso, foi avaliado o impacto dos parâmetros de cultivo: temperatura, tempo de incubação, agitação e Multiplicity of Infection (MOI), na produção viral, comparando-se os resultados obtidos em meio mínimo M9 suplementado com seis fontes de carbono diferentes (acetato, ácido lático, piruvato, glicerol, succinato e glicose) e em meio rico Luria Bertani (LB). Nossos resultados demonstraram que o isolado pertence à família Myoviridae, mais especificamente ao gênero T4. A ausência de genes de patogenicidade e de resistência à antibióticos no genoma do vB_EcoM_UFV09, assim como a lise obrigatória da célula bacteriana após a infecção viral, são características promissoras para a utilização desse fago no controle do crescimento de estirpes da bactéria Escherichia coli. Além disso, a avaliação do impacto das variáveis de cultivo na produção da progênie viral demonstrou que fontes de carbono como succinato, glicose e LB proporcionam condições fisiológicas mais estáveis para a produção fago vB_EcoM_UFV09 em larga escala.Item Atividade da proteína Gp16-43 de Ralstonia virus phiAP1 na inibição e degradação de biofilme bacteriano(Universidade Federal de Viçosa, 2019-02-27) Pereira, Bruna Maria Magro; Zerbini, Poliane Alfenas; http://lattes.cnpq.br/1699435614313133Os vírus que infectam bactérias (bacteriófagos) são os organismos mais abundantes do planeta, e desempenham importantes funções para a manutenção do ecossistema. Nos últimos anos, o uso de vírus como ferramenta de controle biológico tem ganhado bastante atenção, devido, principalmente, à dificuldade de se isolar novas drogas antimicrobianas e à seleção de bactérias resistentes às drogas já existentes. Devido a esse potencial como agentes de controle biológico, as descobertas sobre esses vírus têm aumentado o que amplia as perspectivas de controle de doenças. O biofilme bacteriano representa um importante fator de virulência em bactérias patogênicas. A matriz de exopolímeros presente no biofilme confere limitação à penetração de agentes antimicrobianos e aumenta a tolerância às defesas do hospedeiro, dificultando o controle de bactérias patogênicas produtoras de biofilme. Os bacteriófagos codificam proteínas associadas à lise celular com interessante aplicação no controle desses microrganismos. As despolimerases virais são uma classe de proteínas que desempenham um papel importante no processo de infecção do vírus em seu hospedeiro, atuando na matriz exopolissacarídea do biofilme bacteriano para permitir uma infecção viral eficiente. Desta forma, tem sido apontada como sendo um interessante agente de inibição e/ou degradação do biofilme de bactérias patogênicas. Este estudo traz a caracterização da atividade de uma nova despolimerase associada ao vírion (Gp16-43) codificada pelo vírus Ralstonia virus phiAP1. Gp16-43 foi eficiente para inibir a formação do biofilme de E. coli, R. pseudosolanacearum e S. aureus. Baixas concentrações de proteínas (250- 500 µg/mL) já foram capazes de reduzir a formação de biofilme dessas bactérias. A proteína Gp16-43 foi capaz de degradar o biofilme formado de E. coli e R. pseudosolanacearum, sendo mais eficiente na concentração de 1375 µg/mL, mas não no biofilme de S. aureus. Com base nesses resultados, a Gp16-43, uma nova exopolissacarídeo-despolimerase derivada de vírus, representa uma nova estratégia de grande potencial biotecnológico para prevenir e degradar a formação de biofilme de microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos.Item Caracterização genômica de profagos e de bactérias do gênero Desulfovibrio(Universidade Federal de Viçosa, 2018-07-16) Crispim, Josicelli Souza; Paula, Sérgio Oliveira de; http://lattes.cnpq.br/5230945928388455Bactérias do gênero Desulfovibrio pertencem ao grupo de Bactérias Redutoras de Sulfato (BRS). As BRS causam significativos prejuízos à indústria de petróleo, principalmente devido à capacidade de causar corrosão microbiologicamente induzida, formação de biofilme e produção de H2S. Bacteriófagos são uma forma alternativa para o controle biológico das BRS, cuja informação para este grupo de bactérias, entretanto, é escassa. Assim, este trabalho teve como objetivos: 1) identificar e caracterizar profagos em genomas de Desulfovibrio; 2) verificar a expressão de profagos de Desulfovibrio alaskensis; 3) Isolar, sequenciar e montar genomas de BRS. Para identificação de profagos de Desulfovibrio foram utilizados 46 genomas depositados em banco de dados. 53 profagos completos foram identificados em 46 dos genomas analisados. Estes foram classificados dentro da ordem Caudovirales, com 69,82% pertencentes à família Myoviridae. 18 profagos identificados possuem genes que codificam para lisozima e holina. Quatro dos genomas analisados apresentam profagos com identidade acima de 50% na mesma linhagem, cuja análise comparativa demonstrou a existência de colinearidade entre as sequências. Dos 17 genomas bacterianos fechados analisados, 6 possuem sistema CRISPR-Cas classificado como inativo. A identificação da poli-lisogenia, a proximidade entre os profagos completos e a possível inatividade do CRISPR-Cas nos genomas fechados analisados, permitiu a escolha de linhagens poli-lisogênicas com profagos pertencentes à família Myoviridae para isolamento de profagos e testes em linhagens relacionadas para estudos posteriores. A linhagem D. alaskensis DSM16109 possui três profagos, cuja a expressão e a relação com vesículas de membrana externa foram verificados neste trabalho. A linhagem DSM16109 apresentou menor crescimento após a adição de mitomicina C em relação à cultura controle. Esta redução foi acompanhada da presença de partículas virus-like (VLPs), indicando indução de profagos por mitomicina C. Foi verificado o aumento do número de cópias dos genes cap dos três profagos e transcrição dos mesmos na amostra controle, entretanto, sem a formação de VLPs. Genes de profagos foram identificados em vesículas de membrana externa de culturas tratadas e não tratadas com mitomicina C. Os profagos de DSM16109 são induzidos de forma espontânea, mas, apenas a presença de mitomicina C levou à formação de VLPs. O material genético dos profagos detectado dentro de vesículas de membrana externa podem estar relacionados com a transferência horizontal de genes virais. Nas análises genômicas de isolados de amostras de plataformas de extração de petróleo da Bacia de Campos (RJ) foi verificado que a linhagem P37SLT pertence à espécie Desulfovibrio indonesiensis com 4,2Mb e a linhagem P48SEP pertence à espécie Desulfovibrio marinus com 5,1Mb. Ambas as linhagens foram sequenciadas pelo sistema HiSeq (2x300) e apresentam sequências relacionadas à profagos, uma característica comum do gênero Desulfovibrio encontrada nos genomas anteriormente analisados.Item Isolation and characterization of lytic bacteriophages for the composition of a phage cocktail capable of reducing bacterial biofilms in oil-related environments(Universidade Federal de Viçosa, 2023-07-06) Silva, Jéssica Duarte da; Paula, Sérgio Oliveira de; http://lattes.cnpq.br/0374413607226322Phages are viruses that infect bacteria and since their discovery in the early 20th century, they have been used to control bacterial growth. This work was divided into three chapters. The first genomically and biologically characterizes the Enterobacter phage vB_EclM-UFV01, presenting general characteristics of its genus, the Karamviruses. Chapter 2, examines the capacity of a phage cocktail (composed by enterobacteria-isolated phages) to reduce the biofilm of sulfate-reducing bacteria. The formulation of the cocktail, named Petro01, was performed by selecting phages from the collection of the Laboratory of Molecular Immunovirology at UFV and ended up being composed of three phages of the Tequatrovirus genus (briefly characterized genomically in this chapter) and one of the Karamvirus genus (described in Chapter 1). The stability of Petro01 under conditions similar to those found in petroleum-related environments, its shelf life at high storage temperatures, the supernatant composition (LB enriched with conservative compounds), as well as the propagation capacity of the phages that make up the cocktail in bench and a 12 L bioreactor, was also evaluated. Petro01 showed significant biotechnological potential and positive capacity for the composition of a phage-based product. Chapter 3 moves away from the environmental application of bacteriophages and characterizes, biologically and genomically, the Proteus mirabilis phages BigMira UFV01 and MidiMira UFV02, providing an overview of the common features of their genus, the Acadeviruses. It also presents the genomic evaluation of 10 strains of P. mirabilis, isolated in clinical environments, focusing on the LPS locus and the antimicrobial resistance profile. All phages described in this study have good potential as antibacterial agents. Keywords: Bacteriophages. Industrial microbiology. Sulfate-reducing bacteria. Bioproducing.Item Uso do bacteriófago vB_EcoM-UFV13 como potencial agente antimastítico em vacas leiteiras(Universidade Federal de Viçosa, 2018-04-26) Duarte, Vinícius da Silva; Paula, Sérgio Oliveira de; http://lattes.cnpq.br/7814802722636291A atividade leiteira no Brasil sofreu profundas transformações nos últimos anos no que diz respeito, principalmente, ao aumento da produtividade com um custo de produção cada vez menor. Para que tal resultado seja alcançado, o animal é invariavelmente desafiado a atender altos índices zootécnico. Dentro do manejo sanitário, a mastite bovina ainda é a principal causa de perdas econômicas para produtores de leite, estimado em $ 533 bilhões de dólares em todo o mundo. A Escherichia coli é responsável pela maioria dos casos de mastite ambiental (40%), enquanto que Trueperella pyogenes é um dos principais agentes causadores de mastite em novilhas no período seco. Embora a terapia com antimicrobianos convencionais seja a mais utilizada nos rebanhos, o uso de bacteriófagos como instrumento no controle de patógenos na Veterinária tem ganhado destaque. Neste trabalho, buscamos avaliar o uso do bacteriófago vB_EcoM-UFV13 (UFV13) contra estes dois importantes patógenos causadores de mastite bovina. Em um primeiro estudo, investigamos o uso do fago UFV13 na prevenção da formação do biofilme de T. pyogenes, um dos principais fatores de virulência apresentado por este micro-organismo. Empregando-se duas diferentes metodologias (cristal violeta e contagem de células sésseis), observou-se que somente a multiplicidade de infecção 10 apresentou redução, estatisticamente significativa, do biofilme formado. A análise das proteínas estruturais do vírus UFV13 revelou um repertório de proteínas com domínio hidrolase (Virion-Associated Peptidoglycan Hydrolases – VAPGHs) que potencialmente estão envolvidas no processo de adesão e desenvolvimento do biofilme. No segundo estudo, examinamos o fago UFV13 em termos genômico, a sua estabilidade em diferentes condições adversas, além da sua atividade contra E. coli em camundongos fêmeas lactantes. Estas análises revelaram que o vírus UFV13 é oriundo de uma recente infecção mista com Shigella phage Shfl2. Além disto, sua administração intramamária provocou uma redução de 10 vezes na carga bacteriana total, além de induzir a produção de citocinas pró-inflamatórias como IL-6 e TNF-α. Após esses estudos, a completa caracterização do fago UFV13 o torna um possível candidato para controle da mastite bovina no gado leiteiro.Item Avaliação da tecnologia de bacteriófagos em sistemas de fluxo dinâmico (loopings) para controle de biofilmes e bactérias redutoras de sulfato na indústria do petróleo(Universidade Federal de Viçosa, 2023-02-07) Sousa, Maíra Paula de; Paula, Sérgio Oliveira de; http://lattes.cnpq.br/7452116967390776A aplicação da tecnologia de bacteriófagos na indústria do petróleo tem sido considerada uma alternativa promissora para o controle de contaminações microbianas associadas à biocorrosão e à geração biogênica de sulfeto de hidrogênio (H2S). Essas contaminações estão presentes ao longo de toda a cadeia produtiva do petróleo, representando riscos ocupacionais e operacionais. Seu controle se dá principalmente pela aplicação de biocidas que, em geral, apresentam um baixo poder de penetração em biofilmes e, portanto, são pouco eficazes. Isso ocorre devido às substâncias extracelulares produzidas pelos microrganismos, que funcionam como uma barreira de proteção. Nesse contexto, os bacteriófagos podem conferir vantagens sobre os biocidas, uma vez que: podem se multiplicar no ambiente, possibilitando a redução da dosagem; possuem enzimas capazes de romper a matriz dos biofilmes, conferindo poder de penetração e maior eficácia; e, podem apresentar menores impactos ocupacionais, operacionais e ambientais. O presente trabalho teve como objetivos: (i ) avaliar em sistemas de fluxo dinâmico (Loopings) o efeito de coquetéis fágicos sobre biofilmes enriquecidos com bactérias redutoras de sulfato (BRS), representativos de tanques de plataformas de petróleo; e, (i i ) avaliar um coquetel fágico pré-selecionado quanto a potenciais impactos ambientais e operacionais. Os resultados obtidos demonstraram que os fagos avaliados possuem ação sobre esses biofilmes, com redução de cerca de 80% do H2S gerado e indicaram efeito na desaceleração do processo de corrosão e de formação de pits. Além disso, o coquetel fágico pré-selecionado, apresenta características vantajosas em comparação aos biocidas, tanto do ponto de vista ambiental (menor ecotoxicidade e maior biodegradabilidade), quanto operacional (menor corrosividade e menor impacto sobre o processo de nitrificação do sistema de tratamento biológico de água de produção). Palavras-chave: Biocorrosão. Corrosão Influenciada por Microrganismos. Acidulação Biogênica. Bactérias Redutoras de Sulfato. Sulfeto de Hidrogênio. H2S. Bacteriófagos.Item Avaliação do efeito de um coquetel de bacteriófagos e uma peptideoglicano-hidrolase associada a virion sobre biofilme de bactérias redutoras de sulfato(Universidade Federal de Viçosa, 2021-07-12) Paes, Isabela da Silva; Paula, Sérgio Oliveira de; http://lattes.cnpq.br/0820884110808352O biofilme consiste em um dos grandes associado a indústria de petrolífera, devido à dificuldade na remoção completa dos microrganismos inseridos na matriz. O biofilme formado por BRS é o responsável pelo aumento da concentração de metabólitos corrosivos no interior das instalações metálicas e diferentes abordagens são almejados para mitigar este problema. Os bacteriófagos e suas proteínas líticas, como peptideoglicano-hidrolases associadas a vírions (VAPGH), têm se mostrado uma alternativa para eliminação de microrganismos devido à sua especificidade. No primeiro capítulo deste trabalho foi avaliado o potencial de um coquetel, composto por seis bacteriófagos, na prevenção da formação e remoção do biofilme de culturas mistas de bactérias redutoras de sulfato, isoladas da indústria petrolífera. Foi observado que o coquetel de bacteriófagos proposto preveniu parcialmente a formação do biofilme pela cultura P55(água de injeção]) e P48SEP (separador de produção), e impediu a formação do mesmo para as culturas P48SEP, P55 e P37 (tangue Slop). Ademais, no segundo capítulo foi avaliada a atividade muralítica de uma putativa VAPGH, codificada pelo bacteriófago vB_EcoM-UFV13 e expressa de forma heteróloga, em um sistema procarioto, sobre a formação de biofilme por Escherichia coli. A VAPGH 246 foi expressa a partir da indução com 0,5 mM IPTG e purificada por cromatografia de afinidade. Foi observada a redução significativa do biofilme de E. coli após 24h de tratamento. A presença da enzima, mesmo em baixas concentrações, mostrou ser mais efetivo que o tratamento com o bacteriófago vB_EcoM-UFV13. Desse modo demonstrando o potencial biotecnológico da aplicação de coquetéis fágicos multiespecíficos, assim como potencial das VAPGHs na eliminação e prevenção da formação de biofilmes de diferentes microrganismos. Palavras-chave: Bacteriófagos. VAPGH. Biofilme. Bactérias Redutoras de SulfatoItem Analysis of prophages in Erwinia spp. genomes(Universidade Federal de Viçosa, 2020-02-19) Lima, Thamylles Thuany Mayrink; Alfenas-Zerbini, Poliane; http://lattes.cnpq.br/6311597268935779Bacteriophages can be found in many environments, including water, soil, gastrointestinal system and integrated in host genomes, such as prophages. Prophages can have a positive, neutral or negative effect on their host. They can affect the genetic variability of the bacterial genome, confer a selective advantage to the host, transport virulence factors, introduce new pathogenicity genes and confer new phenotypic properties to their hosts, contributing to their fitness. Bacteria of the genus Erwinia are pathogens that infect a large number of important agricultural crops. Studies on prophages in this group of bacteria are poorly explored. In this work, we examine phages in genomes of Erwinia spp. Phage sequences were identified in 100% of the analyzed genomes. More than one prophage was found in the same genome, characterizing polylisogeny. The analysis of intact phages suggests that they are uncharacterized species, as they showed low identity with virus genomes in public databases. Bacterial genes were found in the phages, assuming horizontal transfer of genes and genes that encode factors that may confer special characteristics to the host were also found. We detected phage spacer sequences at the CRISPR locus of the genomes of Erwinia spp. but we did not find spacers for the prophage residing in the analyzed genomes, suggesting that the prophage residing in the genome were not recognized by the CRISPR-Cas system. Our results show that bacteriophages are widely distributed in the genomes of Erwinia spp. and that may be contributing to your host's fitness. Keywords: PHASTER. Lysogeny. CRISPR-Cas. Bacteriophages. Phytopathogenic bacteria.Item Validação de um sistema de tanques piloto para avaliação do efeito de um coquetel de bacteriófagos sobre o biofilme e produção de H₂S por bactérias redutoras de sulfato(Universidade Federal de Viçosa, 2022-03-07) Vieira, Marcella Silva; Paula, Sérgio Oliveira de; http://lattes.cnpq.br/4403673742342540A corrosão é um processo físico-químico capaz de alterar as propriedades do material exposto a condições corrosivas. O setor de exploração de petróleo é um dos principais setores da economia que sofre com esse processo devido à deterioração de equipamentos, como tanques e oleodutos, que podem acarretar em vazamento de óleo. As bactérias redutoras de sulfato (BRS) constituem o principal grupo relacionado à corrosão microbiologicamente induzida (CMI), gerando prejuízos anuais à indústria do petróleo devido à formação de biofilme e a produção de sulfeto de hidrogênio (H₂S), um gás tóxico e corrosivo. Neste trabalho, um sistema de tanques piloto foi utilizado para simular o armazenamento de fluidos industrial, e inseridos cupons de aço carbono AISI 1020 para formação de biofilme. Nesse sistema, foi avaliado o efeito de um coquetel de bacteriófagos inespecíficos (10^7 UFP/mL), isolados de amostra de água residuais, sobre o biofilme e produção de H₂S de duas culturas mistas de BRS, denominadas AI e AP. Além do coquetel fágico, foi aplicado à cultura AP o biocida comercial sulfato de tetrakis(hidroximetil)fosfônico (THPS), de modo a reproduzir nos tanques o método de rotina empregado na indústria para inibir a biocorrosão. Em células planctônicas, a eficiência dos fagos foi avaliada pela quantificação de H₂S, leitura de DO600nm, contagem do número mais provável de células (NMP) e concentração de ATP total. Para as células do biofilme, foi avaliada a quantificação por NMP de células aderidas, concentração de ATP, perda da massa e taxa de corrosão ocorridas nos cupons, além do efeito sobre a estrutura do biofilme, o que foi verificado por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e pela da rugosidade da superfície obtida por perfilometria óptica. De maneira similar, com exceção à MEV, as mesmas análises foram conduzidas quando THPS estava sob estudo. Os resultados iniciais demonstraram redução de 77,8% na produção de H₂S pela cultura mista AI na presença do coquetel fágico, além de menor perda de massa e taxa de corrosão dos cupons avaliados. A população da cultura mista AP teve o crescimento interrompido pelo biocida, mas com surgimento de células resistentes após 12 dias. Com o coquetel fágico, a cultura mista AP apresentou redução de 26,1% na produção de H₂S, redução da matriz do biofilme formado e menor extensão dos vales desencadeados por pites de corrosão. Os dados obtidos sugerem o potencial biotecnológico do coquetel de bacteriófagos em um sistema piloto, além de propor alterações futuras como concentração, tempo de aplicação e composição do coquetel de modo a abranger os eventuais problemas de biocorrosão. Palavras-chave: Biofilme. Bactérias Redutoras de Sulfato. Bacteriófagos. Corrosão Microbiologicamente Induzida. Tanques piloto